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复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制转座子:存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。引发酶:是依赖于DNA的RNA聚合酶,其功能是在DNA复制过程中合成RNA引物。多顺反子mRNA:一种能作为两种或者多种多肽链翻译模板的信使RNA,由DNA链上的邻近顺反子所界定。1、比较原核生物和真核生物基因组DNA的特点。原核生物基因组结构特点:①基因组很小,大多只有一条染色体②结构简炼③存在转录单元(trnascriptionaloperon)多顺反子(polycistron)真核生物基因组结构特点:●真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜●单顺反子:..断裂基因(interruptedgene)、内含子(intron)、外显子(exon)●非编码区较多多于编码序列(9:1)●、真核生物DNA聚合酶的特性。㈠原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌)性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生链合成--+功能主要是对DNA损伤的修复紫外光引起DNA复制的主要聚合酶,修复;以及在DNA复的DNA损伤还具有3’-制时切除RNA引物并5’外切酶的校对功能,提填补其留下的空隙。高DNA复制的保真性㈡真核生物中的DNA聚合酶αβγδε定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3’-5’外--+++?简述DNA错配修复的过程。DNA修复系统功能错配修复恢复错配:..切除突变的碱基核苷酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复修复嘧啶二体或***化DNA错配修复的过程●Dam***化酶使母链位于5GATC序列中腺甘酸***化●***化紧随在DNA复制之后进行●根据复制叉上DNA***化程度,切除尚未***化的子链上的错配碱基CHAP31、基因、启动子、增强子、全酶、核心酶、核酶、三元复合物、SD序列基因,分子生物学定义:产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。启动子:指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。核心酶:大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个w亚基组成核心酶全酶=核心酶+σ因子增强子:能提高转录起始效率的序列被称为增强子或者强化子三元复合物:开放复合物与最初的两个相结合,并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后,转变成包括RNA聚合酶,DNA和新生的RNA的三元复合物SD序列:。大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装,启动子识别βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成:..rpoC1550001核心酶ω110001核心酶?rpoD700001σ因子存在多种σ因子,用于识别σ不同的启动子真核生物RNA聚合酶酶位置转录产物相对活性对α-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核质hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核质tRNA约10%?真核生物的原始转录产物需要经过的加工过程有:1、在5’端加帽。5’端的一个核苷酸总是7-***鸟核苷三磷酸(m7Gppp)。mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap)。2、3’端加尾,多聚腺苷酸尾巴提高了mRNA在细胞质中的稳定性3、RNA的剪接。参与RNA剪接的物质有snRNA(核内小分子RNA)、snRNP(与snRNA结合的核蛋白)4、、原核生物启动子结构有TATA区:酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开)TTGACA区:提供了RNA聚合酶全酶识别的信号二、真核生物启动子的结构:..常在-25bp左右,相当于原核的-10序列85A97T93A85A63A83A50核心启动子●定义:指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区●作用:选择正确的转录起始位点,保证精确起始?上游启动子元件,AAT)和GC盒(GGGCGG)等●作用:控制转录起始频率。CHAP41、遗传密码有哪些特性?理解掌握其摆动性特性:连续性,简并性,通用性与特殊性,摆动性摆动性:转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合,在密码子与反密码子的配对中,前两对严格遵守碱基配对原则,第三对碱基有一定的自由度,可以“摆动”,这种现象称为密码子的摆动性。?受体臂和密码子臂。tRNA有两个关键部位:●A:接受氨基酸,形成氨酰-tRNA。●与mRNA结合部位—,每加一个氨基酸就是一个循环,每个循环包括哪些步骤??每个循环包括:AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。?AA-tRNA与核糖体结合需要消耗GTP,并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子?肽键的生成是由转肽酶/肽基转移酶催化?移位,核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。需要消耗GTP,并需EF-?:..:起始密码子所编码的氨基酸是Met,起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。原核生物:起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸(fMet),起始AA-tRNA为fMet-、分子伴侣、信号肽、核定位序列同工:代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。分子伴侣:它是细胞中一类能够识别并结合到不完全折叠或搭配的蛋白质上以帮助这些多肽正确折叠、转运或防止它们聚集的蛋白质,其本身不参与终产物的形成。信号肽:常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列(有时不一定在N端)。核定位序列:蛋白质中的一种常见的结构域,通常为一短的氨基酸序列,它能与入核载体相互作用,将蛋白质运进细胞核内。CHAP51、比较PCR扩增和细胞内DNA复制的异同。PCR技术DNA生物复制环境体外复制,加热,90摄氏度左右体内,温和的环境模板DNA单链DNA单链原料4种脱氧核糖核苷酸4种脱氧核糖核苷酸酶主要是DNA聚合酶DNA解旋酶,DNA聚合酶,DNA连接酶等各种酶引物需要人工合成的引物自己合成引物成分步骤变性--退火--延伸解旋-起始-延伸-。在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。PCR扩增,模板DNa94℃变性1min,引物与模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3~5min;在末次循环后,样品仍需继续延伸3~5min以上,确保扩增的DNA为双链DNA。:..94℃预变性3min;94℃变性30s;58℃退火30s;72℃延伸1min30s进行30cycle;72℃继续延伸4min;4℃pause2、在基因操作实践中检测核酸相对分子量的最常用方法是什么?其原理是什么?检测核酸相对分子量的最常用方法:核酸凝胶电泳、分光广度法其原理是:DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。(cDNA的中间片段)?在已知cDNA序列基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。此技术为RACE技术。步骤:,以基因片段内部特异性引物(GSP1)启始cDNA第一条链合成。,纯化第一链。’端加入连续的dCTP,形成oligodc尾巴。,得到目的基因5'端片段并检测。:..技术:是单核苷酸多态性,指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A,T,C和G)的突变而引起的多态性。CHAP61、基因敲除技术的基本原理。基本原理:基因敲除又称基因打靶,该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。。基本原理:RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。CHAP71、操纵子、弱化子、葡萄糖效应(代谢物阻遏效应)、安慰性诱导物操纵子:是基因表达的协调单位,由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。弱化子:当操纵子被阻遏,RNA合成被终止时,起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。安慰诱导物:如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解,这种物质被称为安慰诱导物,如IPTG(异丙基-β–D-硫代半乳糖苷)。葡萄糖效应(代谢物阻遏效应):有葡萄糖存在时,不论诱导物存在与否,操纵子都没有转录活性,结构基因都不表达。。主要内容:①Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码②这个mRNA分子的启动子紧接着O区,而位于I与O之间的启动子区(P),不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。③操纵基因是DNA上的一小段序列(仅为26bp),是阻遏物的结合位点。④当阻遏物与操纵基因结合时,lacmRNA的转录起始受到抑制。:..从而激发的合成。当有诱导物存在时,操纵基因区没有被阻遏物占据,所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。。负控阻遏系统:色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成,当培养基中有足够的色氨酸时,这个操纵子自动关闭,缺乏色氨酸时操纵子被打开,trp基因表达,色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程(而不是诱导过程)中起作用。弱化调控机制细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足,因为阻遏作用只能使转录不起始,对于已经起始的转录,只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少;弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行,在细菌细胞内这两种作用相辅相成,体现着生物体内周密的调控作用。?双启动子的生理功能:这与半乳糖在细胞代谢中的双重功能有关。半乳糖不仅作为唯一碳源供细胞生长,而且与之相关的物质——尿苷二磷酸半乳糖是大肠杆菌细胞壁合成的前体。生长过程中细胞必须随时合成差向异构酶,以保证尿苷二磷酸的供应。在没有外源半乳糖的情况下,细胞通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。因为合成细胞壁过程中对异构酶的需要量很小,本底水平的永久型合成就能够满足生理需要。CHAP81、顺式作用元件、反式作用因子、基因家簇、断裂基因顺式作用元件:影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。反式作用因子:能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上,参与调控靶基因转录效率的蛋白质。基因家族:在基因组进化中,一个基因通过基因重复产生了两个或更多的拷贝,这些基因即构成一个基因家族,是具有显著相似性的一组基因,编码相似的蛋白质产物。:..:在一个结构基因中,编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起,而是常常被长度不等的内含子所隔离,形成镶嵌排列的断裂方式。所以真核基因被称为断裂基因。。***化对基因转录活性的影响机理。为什么说***化密度与启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性(可用图示说明)?***化导致某些区域DNA构象变化,从而影响了蛋白质与DNA的相互作用,抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。***的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合,降低了转录活性:..络氨酸受体蛋白激酶磷酸化导致细胞癌变:络氨酸受体蛋白激酶与表皮生长因子(EGF)相结合后,刺激了该受体蛋白的激酶活性,引发一系列生理反应。原癌蛋白ErbB虽然没有正常络氨酸受体蛋白激酶的胞外结构域,其胞内结构域却具有蛋白激酶活性,刺激细胞持久分裂,诱发癌变。:第一链cDNA的合成是以mRNA为模板,反转录成cDNA,由反转录酶催化,该酶合成DNA时需要引物引导,常用的引物是oligodT。oligodT引物一般包含12~20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸,后面加一个连接引物以便于克隆构建。第二链的合成是以第一链为模板,由DNA聚合酶催化。常用RNaseH切割mRNA–CDNA杂合链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成第二条cDNA的片段,再通过DNA连接酶的作用连成完整的DNA链。