文档介绍：该【从高脂血症大鼠模型大、小肠菌群改变探讨肠道菌群与高脂血症的关系 】是由【1781111****】上传分享，文档一共【45】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【从高脂血症大鼠模型大、小肠菌群改变探讨肠道菌群与高脂血症的关系 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..中文摘要摘要目的:观察饮食性高脂血症大鼠大、小肠菌群变化,比较抗生素干预组与益生菌干预组血脂升高情况,探讨肠道菌群潜在的调脂作用。方法:50只SD大鼠随机均分为5组,A组喂养普通饲料,B、C、D、E组喂养高脂饲料,B组(抗生素干预组)于实验第1天起予甲硝唑、诺***沙星灌胃建立肠道菌群缺陷模型,C组为阳性对照组,D(菌株l干预组)、E(菌株2干预组)于第15天起分别予菌株1、2灌胃,第30天观察结果。第1天、第15天、第30天取大鼠粪便行菌群分析;第1天、第30天测量血脂指标。第30天处死大鼠,取小肠内容物行菌群分析。一结果:高脂饲料组(B、C、E)血胆固醇、LDL较其初始值明显增高,△TC明显高于A组(P<)。但菌株1干预组(D组)TC、TG增高较初始值无统计学意义,且△TC较A组无统计学差异。B、C、E组体重较A、D组明显增高(P<),D组较A组无显著增高(P>)。高脂饮食组大便菌群发生明显改变,嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌计数明显降低(P<),拟杆菌呈现“先增后降”趋势(P<)。小肠菌群相对稳定,C组拟杆菌较A组明显降低(P<),D组小肠拟杆菌、肠球菌、大肠杆菌、金葡菌较A组明显降低(P<)。结论:%胆固醇、5%鲜猪油、10%蛋黄粉、%胆酸钠、84%基础饲料混合制成的高脂饲料连续喂养sD大鼠30天可建立高胆:..硕十学位论文中文摘要固醇、LDL一胆固醇血症模型。(30天)可导致肠道菌群结构的改变,以大肠菌群为主,这种改变可能反过来迸一步促进高脂血症的发展。、抑制脂肪蓄积的潜在益生菌功效,作用点可能位于小肠。关键词:高脂血症;肥胖;肠道菌群;短链脂肪酸-Ⅱ:..硕士学位论文英文摘要ABSTRACTObjective:ToobservethechangesofbothlargeintestinalandsmallintestinalfloraofSDtheelevationofserumparelipidofantibioticsinterventionandbacteriastraininterventiongroupinordertoapproachthelatent":,whileB、C、D、·,surveytheserumlipidatthe1酣day,theday,,:ThelevelofTC、LDLwaselevatedsignificantlyintoitsprimaryconcentration,theincrementofGroupB、C、EcomparedTC(ATC1inthesewashigherthanGroupA(P<).IngroupsGroupD,theelevationofTC、TGwasnotsignificantaswellasATC(P>).TheincreaseofbodyweightinGroupB、C、EWassignificantlythanGroupA,whileWasnothigherthanhigherGroupDapparentlyGroupA(P>).Thefecalmicrobialpopulationalotinchangedin:..硕七学伉论文英文摘要GroupB、C、D、、Bifidobacteria、iwassignificantlydecreased,thecountsofBacteroideswasalsodecreasedafterperiod(P<).Thesmallintestinalaincreasingflorawasrelativelystable,、i、EscherichiacellandgroupD,theusauren￥:%cholesterol、5forage%animaloil、10%eggyolkpowder、%SodiumCholateand84%,:hypeflipidemia;obesity;intestinaiflora;SCFA:..原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作过的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。吼扭年』月丛日作者躲主召刍关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文;学校可根据国家或有关部门规定送交学位论文。日期:监』月翌日作者签名:‘互墨§岛导师签名::..硕士学位论文前言fju菁随着科技的发展和人们生活水平的提高,人体健康引起了世界范围内的关注。自上世纪30年代国外研究者得出“血管壁增厚即动脉粥样硬化症是不正常胆固醇代谢的结果”这一结论以来,已有越来越多的试验和研究表明胆固醇与高脂血症、冠心病等心血管疾病间的关系,对此,有人描述为“onetotwo”规律…,即降低1%的血清胆固醇可随之减少2%患冠心病的危险性。尽管存在着降血脂化学药物,但其可使转氨酶增高等不良反应使入们致力于探索和研究新的安全有效的调脂药物,以嗜酸乳杆菌和双歧杆菌为代表的微生态制剂得到了广泛青睐。益生菌作为“有生命的绿色药品”(1ivingdrugs),已被越来越多的研究证明具有缓和乳糖不耐受、优化肠道菌群、调节粘膜免疫、减轻炎症和过敏反应及竞争性拮抗致病菌、抗结肠癌等生物效应,并对一些临床疾病如特应性皮炎、Crohn病、腹泻、便秘、念珠菌病、泌尿道感染等具有一定疗效,以其优效、安全、符合生态的诸多优点,被越来越多的应用于人类疾病的各个领域”’“4’”。上世纪六十年代,有学者观察到非洲某部落人群在服食大量含野生乳杆菌的发酵牛奶后血清胆固醇水平明显降低“’”,这一现象引起了广大医学科研人员对肠道益生菌降血脂功效及其机制的兴趣和探索,对此的研究日益成为焦点。目前,国外较多体内、体外实验已为数种肠道固有菌的降胆固醇功效提供了依据,并从中思索建立了一系列可能的作用机制理论。实验研究的进展主要包括菌体生长与胆固醇的关系”’9’、HP的影响“““’、胆酸盐的影响““”’“’、胆酸盐水解酶BSH活性“5““”“”、益生元的使用““”、人和动物喂养实验等;所归纳的益生菌降胆固醇作用机理有BSH对胆酸盐的水解作用““8”、细菌对胆固醇的同化作用“、”、胆固醇吸附于细胞膜。“。’、共沉淀作用‘嚣“’及代谢产物短链脂肪酸的作用‘3“”“’等。在益生菌体外降胆固醇的研究中,人们得到了很多具有高胆固醇去除率的菌株,具有潜在的降低人体血浆胆固醇、从而降低心脑血管疾病发病率的重要作用。然而,目前益生菌去除胆固醇的机理并没有定论,体外实验支持的一系列机理假说尚有待迸一步研究证实;关于益生菌在人体内作用机制的报道较少,且侧重于效果,而非机理,临床研究存在着样本量小、服用剂量大、实验期限短、降胆固醇效果不稳定等问题。因此,进一步的研究将集中于作用机理和临床研究上。我国降血脂的益生菌研究还处于起步阶段,主要侧重现象和菌种选育,机理研究和临床应用尚有待加强,使益生菌在降血脂、防治心脑血管疾病方面进一步发挥对人类健康的促进作用。:..硕十学位论文本课题为一项研究SD大鼠肠道固有菌群与饮食性高脂血症之间潜在关联的探索性试验,通过观察饮食性高脂血症大鼠大、小肠菌群变化,比较肠道菌群缺陷组与益生菌干预组血脂升高情况,探讨肠道菌群潜在的调脂作用。2:..,清洁级,雄性,-2月龄,体重160--2009,购于湖南农业大学东创试验动物科技服务部,合格证号:SCXK(湘2002--003)。(中南大学湘雅二医院动物试验部):面粉20%、米粉10%、玉米20%、麸皮25%、豆料20%、骨粉2%、鱼粉2%。高脂饲料:胆固醇1%(湖南天恒生物试剂有限公司,批号:20060537),新鲜猪油5%(自制),蛋黄粉10%(湖南天恒生物试剂有限公司,批号:20061009),%(Sigma),基础(普通)饲料84%。由中南大学湘雅二医院混合加工制成。(一泰中南医药研究有限公司分离)菌株2(一泰中南医药研究有限公司分离)甲硝唑(上海华中药业有限公司,批号20060826)诺***沙星(上海华中药业有限公司,批号20060911)蛋白胨(北京奥博星生物技术责任有限公司,批号:20040615)酵母浸粉(北京奥博星生物技术责任有限公司,批号:20030825)牛肉粉(北京奥博星生物技术责任有限公司,批号:20040607)葡萄糖(湖南师大化学试剂厂,批号:20040208)琼脂粉(北京奥博星生物技术责任有限公司,批号:040415)硫酸镁(河南省焦作市化工三厂,批号:981014)硫酸锰(湖南焦作市化工厂,批号:981014)柠檬酸铵(湖南湘中精细化学品厂,批号:20030409)乙酸钠(广东省台山市化工厂,批号:20030401)磷酸氢二钾(河南省焦作市化工三厂,批号:20010404)吐温--80(西安富力化学厂,批号:031125)***化钠(焦碱基团化学试剂厂,批号:030513)***化钾(北京化学试剂厂,批号:960125)枸橼酸(焦作市化工三厂,批号:20030822):..(北京北化精细化学品有限责任公司,批号:20000809)多聚甲醛(上海凌蜂化学试剂有限公司,批号:040329)氢氧化钠(焦作鑫安科技股份有限公司,批号:030326)盐酸(株洲开发区石英化玻有限责任公司,批号:20050508)无水乙醇(安徽省宿州安特生物化学有限公司,批号:0411073605)(型号:YX一400H)超净工作台(型号:)普通培养箱(型号;—IL)厌氧培养箱(型号:—IE)湘仪离心机(型号:TGL-20M)自动双重纯水蒸馏机(型号:18lOB)电子精密天平(型号:AR2140)LG微波炉(型号:5562MV)电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司,DK一￥26型)Haier冰箱(型号:BCD一215K)尼康数码相机(型号:COOLPIX4500)分光光度计(自备),雄性,清洁级,随机分为5组。阴性对照组A(n=10);高脂饮食组(n=40,均分4组)。高脂饲料组分为:抗生素干预组B(n=lO),阳性对照组C(n=lO),菌株l干预组D(n=lO),菌株2干预组E(n=lO)。,无明显异常后开始试验,试验历时30天(不计观察期)。A组(阴性对照组)喂食普通饲料30天,B、C、D、E组(高脂饲料组)喂食高脂饲料30天,B组每只予甲硝唑+诺***沙星灌胃,持续30天。D、E组于第15天始每日予相应菌株灌胃至试验结束。每三天称量体重,限定大鼠每R进食量为l/tOX体重(g),不限饮水。试验丌始(第l天)测血脂四项(总胆固醇、总甘油三酯、LDL、HDL)、ALT,分析大便菌群(嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、肠球菌、会黄色葡萄球菌、大肠杆菌);第15天分析大便菌群如前:试验结束(第30天)测血脂、分析大便菌群如前,劳处死小鼠,取小肠内容物行菌群(同上)分析。4:..:;大便:,灭菌生理盐水稀释10倍,振荡混匀,于l小时内接种,3小时内放置培养箱中;小肠内容物:颈椎脱臼法处死大鼠,打开腹腔,分离出小肠和盲肠,于回盲部纵向剪丌肠壁,用无菌镊夹取适量成形肠内容物置入lml无菌EP管,电子精密天平称量后予灭菌生理盐水稀释lO倍,振荡混匀,15分钟内送超净工作台接种,3小时内放置培养箱中。(附图1)嗜酸乳杆菌:MRS—X培养基(自制),37"C厌氧培养48d,时;双歧柯菌:LMAVB培养基(自制),37℃厌氧培养484,时;肠球菌:TTC培养基(自制),37。C厌氧培养48,J,时;拟杆菌:KVLB培养基(自制),37"C厌氧培养48d,时;金黄色葡萄球菌:高盐甘露醇培养基(成品),37。C需氧培养244,时;大肠杆菌:伊红一美蓝培养基(成品),37℃需氧培养24z],时。上述菌群的选择性培养及鉴定计数过程大致如下:无菌取成形粪便(小肠内容物)于EP管内,电子天平称量后加入相当于9倍粪便(小肠内容物)重量的灭菌生理盐水稀释为10~,振荡混匀后送超净工作台上用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释至lO~,选择101至10。稀释度样本10u1分别接种在各类培养基上,每个稀释度做三个平行样。按相应要求和条件进行培养后,以菌落形态、革兰氏染色镜捡、生化反应等鉴定计数菌落,求平均值,计算出每g湿便中的菌数。,放置37。C恒温水浴箱中20分钟见上层淡黄色血清析出后取出,放入高速离心机中离心(4000r,3min),用100”ltip头吸出血清移入送检杯内,每样本不少于200pl,一20℃冷冻保存,24h内送中南大学湘雅二医院生化室行Tc、TG、HDL、LDL、ALT检查。;菌株l、×lO℃FO/ml剂量灌胃。。采用SPSS软件包对所得数掘进行结果统计分析。多组均数问及两两比较采用方差分析。5:..硕f学位论文第一二章缶!△Tc结果“±S,mmolL,n=10)注:*30”day与1“day相比P<;帮与A组相比P<。△Tc折线图图表2,,高脂钶料各组大鼠血清总胆固醇有增高趋势,其中B、C、E组第30天Tc值较第1天明显增高(P(),rig增长值与A组相比有显著差异。D组第30天TC值较初始值无明显增高(P>),TC增长值与A组比较无明显差异(P>),但TC增长值与其他高脂饲料组两两比较办无明显差异(P>)。△LDL检测结果(x±S。mmolL,n=10)iL:·30‘day与1,1day相比P<;#与^组相比P<:..△:高脂饲料各组大鼠血清LDL有增高趋势,第30天LDL值与第1天相比明显增高(P<),LDL增长值与A组相比明显增高(P<),但高脂饲料各组|'日J两两相比无统计学意义。△TG检测结果(x±s,mmolL,n=lo)注:*30“day与r‘day相比P<。=,UEgt.△:所有组别大鼠血清总甘油三酯均有增高趋势,除D组外,各组内第30天TG值较第l天显著增高(P<),但包括D组在内各组之间TG增长值两两比较无统计学意义。7:..硕f‘△HDL检测结果“±s,molL,n=lO):所有组别大鼠血清HDL无明显增高或降低趋势(P>),各组之间HDL增长值两两比较无统计学意义。(x±s,molL,n=lO):所有组别大鼠血清ALT无明显改变。“±s,g)注:·与^、D组相比P<。:..:高脂饲料组体重增长较A组快,其中B、C、E组体重增长明显高于A组(P<),D组体重增加幅度低于其他高脂饲料组(P<),与A组相比无统计学差异。处死动物模型时发现高脂饲料组大鼠肝脏颜色普遍变浅,湿重增加,约l/3呈现出典型的花斑样脂肪肝外观(附图2abc)。综上所述,高脂纠料(自制)喂养SD大鼠30天可建立高胆固醇、,并导致脂肪蓄积。虽然部分大鼠出现脂肪肝外观,但总体ALT无明显增高。菌株l干预组(D组)第30天的血清胆固醇较第1天无明显增高(P>),△TC及体重增长与阴性对照组(A组)无明显差异(P>)。、第15天、第30天分别取大便行选择性细菌培养,菌落计数转换为lg值建库,各组内前后对照,分析结果如下;(菌落计数转换为Ig值,x±s,n=10x3)ii:÷与l“day相比P<。:阴性对照组大鼠第30天大便中嗜酸乳杆菌计数较第1天明显增高(P(),与之相反,高脂饲料各组均有降低,其中B、C、D组明砬降低(P<),E组较第l天均数水平降低但其差异不具统计学意义。:..硕i。警俺}仑文第1二章结果注:屿l“day相比P<。图2,:阴性对照组大鼠第30天大便中双歧杆菌计数较第1天明显增高,高脂饲料各组均有降低,且都具有统计学差异。(菌落计数转换为【g值,x士s,n=103)注:}与r‘day相比P<。:..堕兰堂堡堡塞星=::高脂饲料各组拟杆菌的改变呈现出明显的阶段性,第15天大便中的拟杆菌计数较第1天增多,其中,B、c、E组具统计学差异,第30天大便中的拟杆菌计数明显减少,B、C、E较最初水平进一步降低且具有统计学差异,D组也有如上的阶段性改变,但增高与降低均无统计学意义。查!:!:!鱼丝垄塾壅堡查里堑堕坌奎笪鍪丝墨!堕查茎鍪堡竺塑!!:[童::!:!!:!11“day15‘“day30‘“:各组别粪便大肠杆菌计数无明显变化趋势。《茵落计数转换为Ig值,x±s,nelO×3)注:*-bl儿day相比P<。:较阴性对照组,高脂饲料组中肠球菌计数均明显踌低,具有统计学差异。:..硕十学位论文第■(菌落计数转换为Ig值,x±s,n=103):各组别粪便会黄色葡萄球菌计数均无明显变化趋势。综上所述,饮食性高脂血症大鼠模型大肠菌群发生改变,其中,嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌明显降低(P<),拟卡T菌呈现“先增后降”的趋势(P<),而大肠杆菌、金葡菌无明显变化趋势。(菌落计数转换为Ig值,x4-s,n=lO×3)±±-_4-±:各组别小肠双歧杆菌i{数无显著差异。:..硕十学位论文第二章结果注:·与A组相比P<:C、D组较A组小肠拟杆菌计数明显降低(P<),其余各组两两比较无统计学意义。(茵落计数转换为Ig值,x±s,n=lO×3)±±--￥±:·与A、B组相比P<。:D组较A、B组小肠肠球菌计数明显降低(P<),其余各组两两比较无统计学意义。(茵落计数转换为Ig值,x±s,n一10×3)±±±±*±:·<。:D组较A、C组小肠大肠杆菌计数明显降低(P<),其余各组两两比较无统计学意义。:..(菌劾十数转换为Ig值,x±s,n=10×3)±±--I-*±:·与A、B组相比P<。:D组较A、B组小肠金黄色葡萄球菌计数明显降低(P<),其余各组两两比较无统计学意义。综上所述,本试验中各组大鼠小肠菌群的变化不同于大便菌群,嗜酸乳卡T菌、双歧杆菌各组之问无明显差异,阳性对照组(c组)拟杆菌计数较阴性对照组(A组)明显降低(P<),菌株l干预组(D组)小肠拟杆菌、肠球菌、大肠杆菌、金葡菌计数较阴性对照组(A组)均明显降低(P<)。14:..硕十学位论文第二章讨论第三章讨论随着对肥胖、高脂血症、脂肪肝及心脑血管疾病研究的同益增多,人们在不断的探索与完善高脂血症动物模型。Fernandez…’等提出用于建立高脂血症模型的动物,在血清脂蛋白构成及肝脏胆固醇与脂蛋白代谢酶的调节方面,应尽可能与人相近;Kris—Etherton和Dietschy…建议适宜选作高脂模型的动物有:地鼠、豚鼠、恒河猴、狒狒、猪等。在我国,由于大鼠具有价廉、便于饲养、取血方便、有着明确的遗传背景等优点,大鼠高脂血症的模型被普遍应用于降脂药物和保健品的研究。高脂血症动物模型的建立主要有先天性、转基因和化学物质诱导3种,前2种出于来源困难和代价昂贵,限制了其应用,而化学物质诱导法应用广泛,其中的喂养法即通过给动物喂食或灌胃高脂食饵来复制高脂动物模型,是目前最常用的方法。实践证明,加蛋黄粉的高脂饲料造模效果比不加的好,含胆盐的明显优于不含胭盐者(因大鼠无胆囊,加适量胆盐可促进脂类的消化吸收)。本试验选用SD种雄性大鼠,予1%胆固醇、5%鲜猪油、10%蛋黄粉、%胆酸钠、84%基础饲料混合配制高脂饲料,以1/lo×体重(g/d)连续喂养30天,成功的建立出高胆同醇、LDL一胆固醇血症大鼠模型。这种由高脂饲料喂养形成的模型是经消化道给予,不含丙基巯氧嘧啶,形成时间相对较长,与人类由于膳食结构改变而形成的高脂血症相似。本试验在分析各组大鼠血脂、大便菌群的过程中发现,由于个体差异,在随机分组的过程中有时即产生了组与组之间的差别,如试验第l天A、B两组的血清胆固醇和大便嗜酸乳杆菌计数就体现出显著性差异(P<),故认为,在此不平衡的基础上施加干预,而后得出的组问差异,其准确性不足。本试验于第1天、第30天两次采血测鼍血脂,第1天、第15天、第30天三次分析大便菌群,血脂与大便菌群采取同一组内按时间顺序前后对照分析,以及血脂增长值的组I'日j两丽对比,可较为准确的分析血脂与菌群的变化,也便于观察某些指标的变化趋势,如高脂饮食组肠球菌“先增后降”的特点。如果肠道菌群对脂类吸收及高脂血症的形成确实具有重要作用,那么肠道菌群减少或缺陷的大鼠模型,其血脂将发生最显著的改变。为此,本试验设计了可兼杀肠道厌氧菌、G一菌的抗生素干预组(B组),予同等体表面积的人体剂量的甲硝唑、诺***沙星水溶液持续灌胃,但该组在各次大便及小肠菌群分析中,肠道菌群结构与阳性对照组(D组)相似,造模效果不佳,表明甲硝唑与诺***沙星肠道给药无法建立大鼠肠道菌群缺陷模型。国外类似研究中对于该模型的获取主要来自无菌动物和悉生动物,本试验受条件限制未能采用。尽管有研究发现,喂养法建立的高脂血症模型不能导致肠道菌{}丫结构变化,15:..硕十学位论文笫j章讨论但本试验中,高脂饲料组确实发生了大便菌群的明显改变。大便菌群主要反映大肠菌群,高脂饲料连续喂养15天后,大便中嗜酸乳杆菌、双歧杆菌略有增高,30天后明显降低;肠球菌计数第15天无明显改变,第30天明显降低:拟杆菌呈现出“先增后降”的变化趋势,第15天较第l天时明显增高,但第30天又大幅降低。一直以来,大肠在消化道中的功能都被认为