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的再吸附。常用的封闭剂:%-%BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,可以用高浓度(5%)。:在板式ELISA中,%吐温20磷酸盐缓冲液。-可编辑修改-:..即酶标记的抗体(或抗原)是ELISA中关键的试剂。;抗体(抗原)的免疫活性;含有或少含有游离的抗体(或抗原);结合物要有良好的稳定性。结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯度较高的IgG,以免在与酶联结时其他蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本地浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的。酶纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格不贵,受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力,底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等。在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化酶,β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一种糖蛋白,含糖量约为18%,分子量为44000,是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一种卟啉蛋白质。,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,可使酶与蛋白质的氨基酸通过它而联结。有效(结合率达60%-70%)和重复性好。但是交联反应是随机的,结合物的大小不一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。过碘酸氧化法:适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成chiff氏而结合。简单有效。结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶的活性测定,但会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。制得结合物,最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。-可编辑修改-:..酶和抗体均为生物活性物质,易失活。高浓度较为稳定,冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油,加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳***,AP结合物可加叠氮钠)。结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上:%牛血清白蛋白,%吐温20。试剂盒均已用合适的缓冲液配制成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。)HRP的底物DH2+H2O2D+2H2O上式中,DH2为受氧体,H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物,经酶作用后成为有色的产物。DH2如邻苯二***(OPD)、四***联苯***(TMB)和ABTS。OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。TMB经HRP作用后的产物显蓝色。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混合即成应用液。酶反应终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分子醇的过氧化物和尿素过氧化物。AP的底物为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一段时间。AP也有发荧光底物(磷酸4-***伞***),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。对照设定阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照。-可编辑修改-:..多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度想称;在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。(如甲胎蛋白质,癌胚抗原测定等)应含有制作标准曲线用的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。标本的采取和保存体液、分泌物、排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。以血清标本为例,血浆含有纤维蛋白原、抗凝剂,其他成份同血清。血清标本应避免溶血。红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,可能会增加非特异性显色。:在ELISA中一般有3次加样步骤,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。。ELISA属于固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常常用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。:ELISA仪器附有特制的电热块、水浴。若用保温箱:ELISA板放在湿盒内,在盒底垫湿的纱布,最后将ELISA板都放在湿纱布上。反应板均不宜叠放,以保证格板的温度都能迅速平衡。-可编辑修改-:..℃,但具体操作时可根据说明书要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点,一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。,却也决定着实验的成败。ELISA洗涤:达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质,以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说,在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有的特殊的自动洗涤仪外,手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种。1)流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液为蒸馏水,自来水。洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。已有实验表明,流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳。2)浸泡式微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含有疏水基团,也含有亲水基团,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。。反应的温度和时间仍然是影响显色的因素。在一定的时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证试验结果的稳定性,最好在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。,然后将板正确放入酶标比色仪中。-可编辑修改-:..测量读取底物孔(未经任何反应仅仅添加底物溶液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校准零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。结果以光密度(oplicaldensity,OD),先按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为“A492nm”或“OD492nm”。,通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测量范围、线性等等。,准确性为±1%,%。操作时室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细阅读说明书。“有”或“无”的回答,分别用“阳新”、“阴性”表示,在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈现阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本显色的深浅判断强阳性、弱阳性更有意义。在间接法和夹心法ELISA中,阳性孔显色比阴性孔深。竞争法则相反,阴性孔显色比阳性孔弱。两种类型反应的结果判断方法不同。1):cut-offvalue,一般为阴性对照A值加上一个特定的常数(),以此作为判断结果阳性或阴性的标准。:在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下,这种判断法比较合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后,计算S/N值。2)竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应和阴性对照的显色差异,一般均用比色计测定,读出S、P和N的吸光值。-可编辑修改-:..。阴性判定值=×NCX+×PCX阳性A≤阳性判定值阴性A>(%)=(阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照阳性抑制率≥50%为阴性<50%,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个孔之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线的值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央较直线的部分是最理想的检测区域。,优质的试剂,正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。-可编辑修改-:..。欢迎您的下载,资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议,策划案计划书,学****课件等等打造全网一站式需求-可编辑修改-