文档介绍：该【20株禽多杀性巴氏杆菌的分离及荚膜与脂多糖的分型鉴定 】是由【1781111****】上传分享，文档一共【8】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【20株禽多杀性巴氏杆菌的分离及荚膜与脂多糖的分型鉴定 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..2021年(第46卷)第1期试验研究·43·20株禽多杀性巴氏杆菌的分离及荚膜与脂多糖的分型鉴定仇桂玲1,钟嘉诚2,谭结敏1、邓银燕1,姚红清1,张溢珊3,朱婉君3,王贺2,刘英慧2,陈济铛2,3,张济培2,3*(,广东佛山528500;,广东佛山528231;,广东佛山528225)摘要:本试验在2018~2019年期间对经临床症状与病理剖检作初步诊断为禽霍乱的临床病例,从心血和肝脏进行细菌分离并纯化出20株细菌,经培养特性与菌体形态观察、生化鉴定及种特异性PCR鉴定,确定20株分离菌株均为多杀性巴氏杆菌。采用荚膜多重PCR和脂多糖多重PCR对20株多杀性巴氏杆菌进行分型鉴定,结果荚膜型以A为主,脂多糖型以L1为主,表明目前广东家禽中的多杀性巴氏杆菌仍以A:1(NAMIOKA分型方法为A:5)为主要血清型。药敏结果显示有70%的分离菌对四环素耐受,对其他药物的耐药率均在15%以下。致病性试验结果表明,分离菌株对鹅具有强致病性,引起发病鹅的多种组织出血和坏死;经病理组织切片可见多杀性巴氏杆菌典型的病理组织学变化。试验结果为广东省部分地区禽霍乱的流行病学监测和防治提供参考依据。关键词:禽多杀性巴氏杆菌;分离鉴定;基因分型;药敏试验;致病性+2文献标识码:A文章编码:1005?8567(2021)01?0043?07中图分类号:,霍乱[4]。如何有效防控该病,生产中越来越受关是由多杀性巴氏杆菌引起的一种侵害家禽和野禽注。本试验在2018~2019年间从广东多地养殖场的接触性传染病。多杀性巴氏杆菌属条件性致病发生疑似禽霍乱的病禽组织中分离鉴定出20株多菌,可在某些健康家禽的呼吸道存在,在应激、营杀性巴氏杆菌,进行了基因分型、药敏试验和致病养不良、发生其他疾病等因素下导致机体抵抗力下性试验,试验结果为本地区防治禽霍乱提供了参降而发病。广东地处亚热带气候,天气潮湿炎热,考数据。适合多杀性巴氏杆菌生长繁殖,容易引起禽霍乱的发生,以往多见健壮的中龄肉用禽群发病,[]。,但不同血清型菌株之间的交叉免在2018年1月至2019年7月期间,采集来源疫保护力较低,且免疫保护周期短,免疫效果欠理于佛山市、江门市、惠州市、清远市、汕头市、阳江市想,因此临床可见禽群在接种疫苗后仍会发生禽和东莞市的20份病例样品,其中鸡6例,鸭1例,收稿日期:2020?08?11基金项目:广东省乡村振兴战略专项资金(农村科技特派员)项目(163?2019?XMZC?0009?02?0075);佛山市高明区科技创新专项资金扶持项目(2017C01)作者简介:仇桂玲(1979),女,兽医师,本科,主要从事动物疫病监测与预防控制。E?mail:****************通讯作者:张济培,E?mail:***************:..·44·试验研究20?仇桂玲,等例。、荚膜分型PremixrTaq、pMD18?T、MarkerDL2000和引物和脂多糖分型引物分别参考TOWNSEND等、DH5α感受态细胞均购自TaKaRa公司;SanPrep柱HARPER等的引物[5,6](见表1),由生工生物工程式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有(上海)股份有限公司合成。限公司;药敏纸片,上海源叶生物科技有限公司;,石蜡切片机、恒温箱、立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PCR仪,购自广东省佛山市三水区某肉鹅养殖场。Eppendorf;电泳仪和凝胶成像系统,BIORAD;?120?02,Shimadzu;、LB肉汤培养基和MH琼脂培养基,广东环凯对送检病禽进行剖检,观察与记录病理变微生物科技有限公司;脱纤维羊血,南京茂捷微生化。采取病禽的心血涂片和肝组织触片,作瑞氏物科技有限公司。染色,显微镜观察。表1PCR引物基因型基因引物名称序列(5’?3’)条带大小(bp)退火温度(℃)KMT1?AGTGGAllKMT146055KMT1?ACCAPA?AAAATCGCAGTCAGAhyaD?hyaC1,04455CAPA?ATCATTGTCAGTGCAPB?BbcbD76055CAPB?CAPD?DdcbF65755CAPD?ATATCAGCAPE?GCAGAAAATTATTGACTCEecbJ51155CAPE?RGCTTGCTGCTTGATTTTGTCCAPF?FAATCGGAGAACGCAGAAATCAGFfcbD85155CAPF?GTCAATTACTCTGpcgDL1?GL1130752pcgBL1?nctAL2?FCTTAAAGTAACACTCGCTATTGCL281052nctAL2?TTGGGATAGCgatFL3?ATCL347452gatFL3?AAATCTGAATGGAlatBL4?GL455052latBL4?rmlAL5?FAGATTGCATGGCGAAATGGCL5117552rmlCL5?nctBL6?AAGGL666852nctBL6?RAATGAAGGTTTAAAAGAGATAGCTGGAGppgBL7?L793152ppgBL7?AACGCnatGL8?FGAGAGTTACAAAAATGATCGGCL825552natGL8?TGGTTCATATATAGGTAGG:..?仇桂玲,等·45·,37℃恒温培育18h,观察细菌各病例病死禽均呈现败血症特征(图1A),可生长情况与菌落形态,挑取单菌落涂片作革兰氏见心冠脂肪及心内外膜斑点状出血(图1B),肺脏染色后镜检。挑取单菌落于鲜血琼脂培养基上作广泛性出血、水肿(图1C),肝脏稍肿、暗红色、表面划线纯化培养,37℃恒温培育18h,加20%甘油保有大量灰白色针头大小边缘整齐的坏死点(图1D),脾脏肿大、斑点状坏死(图1E),肠管鼓胀、肠存于-20℃冰箱备用。、肠粘膜弥漫性出血呈“红布分别从20株分离菌的纯化培养物中挑取单个样”(图1F、图1G),卵巢充血出血,卵子变性、变形菌落接种到含5%小牛血清的LB肉汤培养基中,(图1H),公禽睾丸出血(图1I)。37℃摇床培养18h,取10μL菌液加入含5%小牛血清的微量生化鉴定管(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、脲酶、氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、VP、吲哚)中,置于37℃恒温箱培养24~36h,观察并记录ABC结果。(含5%小牛血清)中,37℃摇床培养18h,煮沸法提取DEFDNA。参考TOWNSEND和HARPER的PCR方法对巴氏杆菌种特异性基因、荚膜分型基因和脂多糖分型基因进行扩增[5,6]。?A4中的苛养菌抗生素药物敏感性试图1病死禽主要剖检病理变化验纸片法进行[7]。将20株分离菌的纯培养物接种到MH肉汤中(含5%小牛血清),37℃、150r/(1000×)摇床培养18h,,取菌液涂布于MH琼脂培养基(含5%脱纤维绵羊血),待液病禽心血和肝组织涂片,用瑞氏染色,油镜下体稍干后,将药敏试纸平贴于琼脂表面,置37℃可见菌体两极浓染的卵圆形短杆菌(图2A);分离培养24h后观察,量取抑菌圈的直径,按照CLSI?菌株经纯化,在鲜血平板上生长不溶血,边缘整M31?A2标准判定结果齐、湿润隆起、半透明、圆形的灰白色菌落(图2B);[8]。,结果可见,分将40只60日龄黑鬃鹅随机分为8组。选取来离菌为革兰氏阴性的小杆菌(图2C)。自不同地区的7株分离菌,纯培养18h后用灭菌生8CFU/mL,分别编号为Pm?1~Pm?理盐水稀释至107,分别对1~,第8组为注射灭菌生理盐水()对照ABC组,隔离饲养观察。选取3只眼观病变明显的致死图2菌落与菌体形态观察实验鹅,采取心、肝、脾、肺、十二指肠等组织用10%福尔马林溶液固定,制作组织切片,HE染色,观察各组织病理变化[9,10]。,各生化试管经37℃培养24~36h:..·46·试验研究20?仇桂玲,等20株分离菌生化试验结果生化试验项目葡萄糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖脲酶氧化酶鸟氨酸脱羧酶VP吲哚+--++-+--+P?384+---+-++-+P?390+--++-++-+P?391+-+++-++-+P?393+--++-++-+P?394+---+-+--+P?395+--++-++-+P?396+--++-++-+P?397+--++-++-+P?398+--++-++-+P?399+--++-++-+P?3100+--++-++-+P?3101++-++-++-+P?3102+--++-++-+P?3103+-+++-+--+P?3104+--++-++-+P?3105+--++-++-+P?3106+--++-++-+P?3107+--++-++-+P?3108+---+-++-+注:+为阳性;-为阴性后,20株分离菌对葡萄糖、蔗糖、氧化酶和吲哚均呈阳性,对脲酶和VP均呈阴性,甘露醇和鸟氨酸脱羧酶试验中大部分呈阳性,而乳糖和麦芽糖试验大部分呈阴性。,经注:M为DL2000Marker,泳道1~%琼脂糖凝胶电泳,结果显示20株分离菌均可图320株Pm菌株荚膜分型基因PCR电泳结果扩增出约460bp的目的条带,与预期扩增的目的片段相符。克隆测序结果显示分离菌扩增的条带与GenBank上的多杀性巴氏杆菌菌株KMT1基因比对,相似性为99%以上,确定20株分离菌均为多杀性巴氏杆菌。多重荚膜PCR结果显示,20株分离菌中,有2株无法定型,其余18株均为A型(见图3)。多重脂多糖PCR结果显示,20株分离菌中,1株属于L3,注:M为DL2000Marker,泳道1~20为Pm样品1株属于L6,其余18株属于L1(见图4)。各菌株基图420株Pm菌株脂多糖分型基因PCR电泳结果因分型结果见表3。:..20?仇桂玲,等试验研究·47·表320株Pm菌株的荚膜型与LPS型脾脏可见红髓增宽白髓萎缩,红细胞浸润(图5C)LPS型淋巴细胞坏死、崩解,见大量蓝染核碎屑散在分布菌株地区宿主荚膜型P?3108东莞市***AL1(图5D);肺脏小支气管内有大量脱落的支气管上P?391惠州市***—L1皮细胞,细支气管内有大量红染的浆液(图5E),P?390江门市肉黑棕鹅AL1肺泡腔中可见红细胞和粉红色纤维素(图5F);十P?397AL3江门市种白番鸭二指肠肠绒毛上皮细胞完全脱落(图5G)。图见第P?382清远市***AL152页。P?393佛山市***AL1P?399清远市***AL1P?3101AL13讨论惠州市***P?3106清远市种黑棕鹅AL1试验从20例疑似急性禽霍乱病例的心血和肝P?3102汕头市种狮头鹅AL1脏中分离获得20株细菌,通过其培养特性、菌体观P?3105汕头市种狮头鹅AL1察、生化试验及种特异性PCR鉴定,均鉴定为多杀P?3103AL1阳江市种白沙杂鹅性巴氏杆菌。20例均表现为突发性的急性临床发P?3104阳江市种白沙杂鹅AL1病过程,病死禽表现为典型的急性败血症,器官浆P?3107佛山市肉用白鹅AL1膜和黏膜严重出血,肝脏和脾脏坏死为特征。选P?384佛山市种黑棕鹅AL1P?394AL1取7株多杀性巴氏杆菌对60日龄鹅进行致病性试肇庆市种黑棕鹅P?395AL1验,在48小时内试验鹅均出现与临床病例一致的佛山市种狮头鹅P?396佛山市种黑棕鹅AL1败血症特征。人工致病鹅组织病理学观察可见心P?398L6肌断裂坏死、肝细胞空泡化与变性坏死、脾脏组织肇庆市种黑棕鹅—P?3100AL1肇庆市种狮头鹅有坏死灶、肺小叶间质充血、十二指肠绒毛上皮细注:“—”为无法定型胞完全脱落等特征,与吕荣修和SAIF等人报道结果相似[3,11]。20株分离菌荚膜多重PCR检测结果显示,除1株鸡源和1株鹅源菌株未能定型外,其余18株分Pm菌株的药物敏感性试验结果按照离菌均为A型;脂多糖多重PCR结果显示,其中18CLSI?M31?A2标准进行判定,结果见表4,75%以株菌为L1,另外2株分别为L3和L6,这表明本试上的菌株对头孢唑啉、庆大霉素、***苯尼考、复方新验分离的20株菌以荚膜A型和脂多糖L1型为主。诺明和环丙沙星表现敏感,耐药率最高的抗菌药由于本试验的脂多糖分型技术采用HARPER方物是四环素(70%),其他药物的耐药率均等于或低法,其中L1对应HEDDLESTON脂多糖1型和14于15%,丁***卡那、诺***沙星和恩诺沙星的中介率型,同时L1也对应NAMIOKA分型方法中的5型,高达75%以上。因此,,都以A:1(NAMIOKA分型方法为感染组Pm?1~Pm?7的35羽鹅48h内全部死A:5)为主[12?14]。目前用于家禽免疫的疫苗主要有亡,可见与临床病例一致的病理变化,并从所有死禽霍乱弱毒活疫苗、禽霍乱铝胶灭活疫苗、禽霍乱亡鹅只的心血和肝脏组织中均分离出多杀性巴氏蜂胶灭活疫苗、禽霍乱油乳剂灭活疫苗等,虽然禽杆菌。接种生理盐水对照组鹅未见异常,扑杀后巴氏杆菌流行血清型较为单一,但家禽在接种疫未从心血和肝脏分离到细菌。对发病死亡鹅的心、苗后仍有发病的情况,这除了灭活疫苗存在交叉肝、脾、肺、十二指肠进行组织切片观察,可见心脏免疫保护力不足和免疫保护期短、弱毒株活疫苗的心肌纤维断裂,心肌纤维间隙有红细胞浸润(图菌株状态不稳定,时常发生毒力返强等疫苗因素5A);肝细胞细胞核固缩、裂解,脂肪变性(图5B);外,更重要的是饲养管理因素的影响,恶劣的饲养:..·48·试验研究20?仇桂玲,等20株Pm的药物敏感性试验结果药物种类地区宿主氨苄西林头孢唑啉庆大霉素丁***卡那四环素***苯尼考复方新诺明诺***沙星恩诺沙星环丙沙星清远鸡SSSIRSSIISP?384SSSIRSSIIS佛山鹅P?390江门鹅ISSIRISIISP?391惠州鸡ISSIRSSIISP?393佛山鸡ISIIISSIISP?394RSSIRSSRII肇庆鹅P?395佛山鹅ISSSRSSIISP?396佛山鹅SSSIRSSRRIP?397SSSISSSIIS江门鸭P?398RRSIRISSSS肇庆鹅P?399清远鸡SSSIRSSIISP?3100肇庆鹅SSSSSSRIISP?3101ISSSRSIIIS惠州鸡P?3102汕头鹅ISSISSSIISP?3103阳江鹅SSIIRISIISP?3104阳江鹅SSRIRISIISP?3105RSIRRSSIII汕头鹅P?3106清远鹅ISSIISSIISP?3107佛山鹅ISSIRSSSSSP?3108东莞鸡SSSSIISIIS45%95%80%20%15%75%90%10%10%85%敏感菌株占比中介菌株占比40%0%15%75%15%25%5%80%85%15%耐受菌株占比15%5%5%5%70%0%5%10%5%0%注:S为敏感状态;I为中介状态;R为耐受状态环境、劣质的饲料和不洁净的饮水是禽霍乱反复发慎重选择以上4种药物,降低形成药物耐受的风病的主要原因[4,15]。因此,在拥有良好饲养管理险,临床要科学合理的使用抗生素,使用时要考虑条件的基础上,配合疫苗的使用,对防控本病具有抗生素的质量、剂量、疗程和使用方法,以减少耐重要意义。药性的产生。从20株多杀性巴氏杆菌的药敏试验结果可见,大部分菌株对头孢唑啉(95%)、庆大霉素4结论(80%)、***苯尼考(75%)、复方新诺明(90%)和环丙本次试验所分离的20株多杀性巴氏杆菌,血沙星(85%)的敏感度较高,仅对四环素(70%)表现清型以荚膜A型和脂多糖L1型为主,菌株的总体较严重耐药,因此总体的耐受程度不高,但有40%药物耐受程度较低,对家禽具有强致病性。以上的多杀性巴氏杆菌对氨苄西林(40%)、丁***卡那(75%)、诺***沙星(80%)和恩诺沙星(85%)处于参考文献:中度敏感状态,该结果提示广东部分地区的多杀[1]、丁***卡那、诺***沙星和恩测预警系统的研究[D].,,因此在治疗时应:..20?仇桂玲,等试验研究·49·][D].,.[3]SAIF,FADLY,GLISSON,[M].中国农业[9]于洁,季昌华,管冰心,[J].出版社,,2018,34(03):345?346.[4]罗青平,杨峻,温国元,[J].[10]程礼敏,吴敏,姚建设,?伊红染色制湖北畜牧兽医,2012(12):14?[J].齐齐哈尔医学院学报,2016,37(07):919?[5]TOWNSENDKM,BOYCEJD,CHUNGJY,[11]***谱[M].北京:中国农业大学出版ofamultiplexcapsularPCRtypingsystem[J].Journalof社,,2001,39(3):924?929.[12]王林柏,孙久鹤,郭东春,[6]HARPERM,JOHNM,TURNIC,[J].中国预防兽医学报,2016,rapidmultiplexPCRassaytogenotypePasteurellamultocida38(02):116?[13]高明燕,韦玉勇,周生,[J].JournalofClinicalMicrobiology,2015,53(2):477?荚膜与脂多糖分型鉴定—以2009?2017年华东地区为例[J].,2019(08):19?21.[7]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)2013.[14]程龙飞,许利娜,林建生,[J].中国动物传染病学报,2014,22(04):susceptibilitytestsforbacteriaisolatedfromanimals;approved40???.[15]梁圣,赵新新,[J].畜[8]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI),2018,49(11):2317?。猪粪清出到发酵笔者根据多年生产实践,总结出了本套发酵床后,4~9月份应立即翻耙,其它时间可在空闲时床制作程序,希望能减轻养殖环境污染压力。然翻耙。翻耙频率与苍蝇卵的发育有关,苍蝇卵的而,目前发酵床技术仍然无法解决臭味问题,无论发育时间为8~24小时,与环境温度、湿度有关,是开放式还是封闭式,臭味最终都要排放到大气卵在13℃以下不发育,低于8℃或高于42℃则死环境。只能采用其它技术尽量减少臭味的排放,亡,垫料越厚,越不利于孵化。采用人工翻耙的,如饲料中减少蛋白质增加青粗饲料、饲喂益生菌、遇高温季节,宜选择早晨或傍晚翻耙垫料。采用场区种树等。因此,如何解决发酵床臭气的问题翻耙机的,应注意是否会出现动力不足,翻耙机原需要进一步研究探讨。地不动或者导轨上粘有粪便造成打滑等情况。:垫料含水量保持在60%左右,一旦出现过湿[1]-2006《畜禽养殖场环境污染控制技术现象应立即添加锯末,防止菌种死亡。垫料使用规范》[Z].。两年后重新换垫料,接种。发[2]-200144/613-2009《畜禽养殖业污染物排放标准》[Z].,垫料内温度未达到40℃以上,垫[3]-2006《畜禽粪便无害化处理技术规料一直潮湿,不干爽,即为“死床”,需重新接种、范》[Z].。:..·52·2021(第46卷)第1期ABCDEFGHI:子孢子入侵HCT?8细胞(6h);B:滋养体(24h);C:子孢子发育(30h)D:第一代裂殖体(48h);E:第一代裂殖子释放(54h);F:第二代裂殖体(72h);G:第二代裂殖体破裂(104h);H:第二代裂殖子释放(144h);I:第二代裂殖子释放(168h)图子孢子在HCT?8细胞中的发育过程(DAPI染色)ABCDEFG注:A、B、D、F、G:400×;C、E:100×仇桂玲等图5人工致病鹅的病理组织学变化(HE染色)