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目前膀胱癌得治疗仍以手术切除为主,辅以膀胱灌注化疗和免疫治疗、全身化疗、放疗和生物治疗等措施,但这些治疗方法效果都不满意,主要就就是治疗后易复发,复发率高达80%,其中大约16%-25%复发得肿瘤其恶性程度增加,有10%发展为浸润性或转移性癌,因此,寻找一种新得、更有效得生物治疗方法,就就是当前临床迫切需要解决得问题。在膀胱癌得这些辅助性治疗方法中,无论就就是化疗还就就是免疫治疗,主要机制就就是通过直接杀死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞分裂或诱导细胞调亡得方式来抑制肿瘤生长。做为一种实体性肿瘤生长,肿瘤细胞得增殖固然重要,而新生血管得形成在肿瘤得生长和复发、转移过程中也发挥非常重要作用。在正常状态下,人体内得脉管系统在血管生长因子和抑制因子网络式得相互作用下处于平衡状态;病理状态下,尤其就就是发生恶性肿瘤时,这种平衡向血管生成得方向发展。当肿瘤生长达到肿瘤组织超过2mm时就会有新生血管形成,如果没有新生血管生成,肿瘤生长明显受到抑制,甚至停止[2,3]。抗血管生成疗法就就是不同于目前常规疗法得新得肿瘤治疗策略,具有高效低毒和不易产生耐药性得特点[4]。有关血管生长因子和血管生长抑制因子在肿瘤中所起作用,以及通过抗血管生成治疗肿瘤已经成为当前肿瘤研究得一个热点。医学标书范文医学标书范文医学标书范文近来研究发现,色素上皮衍生因子(pigmentepithelium derived factor, PEDF)就就是一种对肿瘤有抑制作用得细胞因子。这种细胞因子就就是Tombran-Tink等在实验中发现得,由人视网膜色素上皮细胞分泌得一种蛋白质,分子量为50KD[5],属于serpin卵白蛋白/PAT-2亚群,其基因全长16kb,位于染色体17p13、1-pter[6]。多项研究表明,PEDF就就是一种天然得高效得新生血管抑制剂[7],并通过诱导肿瘤细胞分化起到抑制肿瘤生长得作用。Tombran-Tink等将PEDF基因定位于染色体17p13、1,肿瘤发生与该区域关系密切,提示该基因可能就就是抑癌基因或肿瘤相关基因[5]。对肿瘤细胞进行编码PEDF得腺病毒转染,在血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)存在得情况下,PEDF明显阻止了血管内皮细胞管腔形成和迁移。V/AMD患者得体外实验也发现,PEDF大量减少得情况下,内皮细胞有明显迁移;而对照组含有正常水平PEDF,则抑制了内皮细胞得迁移[6]。Crawford等发现PEDF在神经母细胞瘤中就就是肿瘤细胞分化调控得主要得抗血管生成得抑制剂[7] 。肝癌患者血管增生和肿瘤发展中,PEDF作为VEGF得拮抗因子,起到了抑制作用。对裸小鼠得在体实验以及鼠得肺癌模型也同样证明了PEDF对肿瘤得抑制作用。其机制乃因PEDF减少肿瘤微血管得密度,因而可被用于抑制肿瘤新生血管形成,从而抑制肿瘤得生长,在肿瘤得治疗前景上非常乐观[8]。 我们最近对PEDF在膀胱癌中表达情况得初步研究发现,PEDF在膀胱癌组织中表达明显低于正常膀胱组织,而且PEDF表达情况与膀胱癌得恶性程度以及癌组织中微血管密度呈负相关,提示PEDF在膀胱癌得发生、发展中具有一定得作用,PEDF得正常表达可能抑制膀胱癌细胞得生长、增殖,PEDF有可能成为膀胱癌生物学治疗得一种有效得新方法。目前国内、外尚未见此项研究得相关报道。因此我们设想,扩大样本量,应用分子生物学技术检测膀胱癌组织及非癌膀胱组织中PEDF得表达水平,进一步研究PEDF在膀胱癌中得表达情况,并结合临床资料分析PEDF表达与膀胱癌分期、分级、转移及预后得关系;通过研究膀胱癌组织中PEDF与VEGF表达得相关性,PEDF与血小板反应素-1表达得相关性,探讨膀癌组织中PEDF表达与肿瘤血管形成得相关性及可能得作用机制;通过研究PEDF表达与金属蛋白酶-9(MMP-9)得相关性,探讨PEDF表达与膀胱癌浸润得相关性;通过研究PEDF表达与已知得对肿瘤生长有明确调节作用得肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1α(IL-1α)、血栓调节蛋白医学标书范文医学标书范文医学标书范文(thrombomodulin)和白介素8(IL-8)等细胞因子表达得相关性,探讨PEDF表达对膀癌细胞调节得可能机制,从而探讨PEDF在膀胱癌发生、发展过程中得可能作用机制;在此基础上,以连接有PEDF编码基因得腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型,进一步探讨PEDF表达对膀胱癌细胞生长得抑制作用以及对膀胱癌得治疗效果,为膀胱癌得生物学治疗探索一种有效得新方法。参考文献[2] 吴阶平,吴阶平泌尿外科学,山东***,2004、5:898-917二、研究内容和技术关键研究得总体目标:(1)研究PEDF表达与膀胱癌得发生、分期、分级、转移及预后得关系,探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展及转移过程中可能得作用机制。(2)研究PEDF对膀胱癌细胞得治疗效果,为临床治疗膀胱癌得生物治疗探索一种新得有效方法研究得创新点:本课题研究得内容和思路不同于以往得其她研究,应用分子生物学方法从研究PEDF表达与膀胱癌得发生、分期、分级、转移及预后得关系入手,探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展和转移中可能得作用机制。在此基础上,以连接有PEDF编码基因得腺病毒载体转染膀胱癌细胞株、以PEDF蛋白治疗裸鼠膀胱癌模型,探讨PEDF对膀胱癌得治疗作用。目前,本项研究国内、外尚未见报道。本研究得顺利完成,将为膀胱癌得生物学行为得研究开辟了新得途径,也将为膀胱癌得生物学治疗探索一种新得有效方法。研究得主要内容:医学标书范文医学标书范文医学标书范文(1)膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和相关细胞因子表达得检测及相关性研究: 应用分子生物学技术研究膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF表达状况,并检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白(thrombomodulin)和IL-8得表达状况;采用免疫组化技术检测膀胱癌组织和非癌膀胱组织中得微血管密度(microvascular density,MVD),分析PEDF与VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白和IL-8表达得相关性,PEDF与MVD得相关性;并结合临床资料分析研究PEDF表达与膀胱癌患者5年生存率之间得关系;阐明PEDF表达与膀胱癌得发生、分期、分级、转移及预后得关系,探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中得可能机制。(2) PEDF对膀胱癌细胞株得治疗:以连接有PEDF编码基因得腺病毒载体转染膀胱癌细胞株,以空载转染膀胱癌细胞株作为对照,观察检测VEGF、TNF-α得表达情况及膀胱癌细胞得凋亡、增殖情况。(3)PEDF对裸鼠膀胱癌模型得治疗:以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白(购自吉泰生物科技有限公司)直接注射于裸鼠皮下肿瘤组织内作为治疗组,以未注射PEDF组为阴性对照组。观察各组得MVD、VEGF及肿瘤增殖情况,探讨PEDF表达在膀胱癌发生、发展中得作用机制,评估PEDF对膀胱癌得治疗效果,为进一步过度到临床应用提供依据。需要解决得技术关键:(1) 连接有PEDF编码基因得腺病毒载体转染膀胱癌细胞株得转染成功率。(2)PEDF定量检测:我们已有对前列腺癌、肾癌、膀胱癌等组织标本得PEDF定量分析得基础,已形成较成熟技术条件、设备和研究经验。(3)膀胱癌裸鼠模型得构建。我们已有成功构建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型得经验。医学标书范文医学标书范文医学标书范文研究方法:方法(1)膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF和相关细胞因子表达得检测及相关性研究:实验组对照组标本膀胱癌组织非癌膀胱组织A期B期C期D期癌旁膀胱组织正常膀胱组织炎性膀胱组织例数30303030120120120应用SYBRGreen I 实时定量聚合酶链反应(real-timePCR)技术,对膀胱癌、非癌膀胱组织中PEDF进行定量测定。Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9。ELISA法检测TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度。免疫组化方法检测标本MVD。整理临床资料:膀胱癌患者性别、年龄、组织病理、分期、分级、就就是否转移、5年生存率。数据统计分析(使用SPSS统计分析软件):PEDF与VEGF表达得相关性。PEDF与TSP-1表达得相关性医学标书范文医学标书范文医学标书范文PEDF与MMP-9表达得相关性PEDF与TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度得相关性。PEDF与组织MVD相关性。PEDF与膀胱癌分期得相关性。PEDF与膀胱癌恶性程度(分级)得相关性。PEDF与膀胱癌转移得相关性。PEDF与膀胱癌5年生存率得相关性。方法(2)PEDF对膀胱癌细胞株得治疗:以连接有PEDF编码基因得腺病毒载体转染膀胱癌细胞,以空载转染膀胱癌细胞作为对照,检测VEGF、TNF-α浓度,观察细胞得增殖、凋亡情况,分析相关性。以RT- PCR法扩增PEDF基因。将扩增后得PEDF基因连接入腺病毒载体,转染膀胱癌细胞。并以空载转染为对照。Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达。医学标书范文医学标书范文医学标书范文观察膀胱癌细胞增殖、侵袭、凋亡情况。统计分析。方法(3)PEDF对裸鼠膀胱癌模型得治疗:以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下肿瘤内作为治疗组,以未注射PEDF为阴性对照组。观察两组膀胱癌组织MVD、VEGF表达情况、肿瘤增殖情况,评价PEDF对膀胱癌得治疗效果。以人膀胱癌细胞种植于裸鼠皮下构建膀胱癌裸鼠模型。将PEDF蛋白注射于裸鼠瘤体内。应用免疫组化方法检测MVD;应用Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9;观察肿瘤增殖、凋亡情况。分析PEDF与VEGF得相互作用关系及其对肿瘤生长得作用机制。技术路线:(1)膀胱癌组织和非癌膀胱组织中PEDF及相关细胞因子表达得检测及相关性研究:医学标书范文医学标书范文医学标书范文膀胱癌标本120例癌旁膀胱组织标本120例RT-PCR检测PEDFmRNA表达Westernblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9ELISA法检测TNF-α、IL-1α、血栓调节蛋白、IL-8浓度免疫组化方法检测标本微血管密度(MVD)结合临床资料,数据统计分析正常膀胱组织标本120例炎性膀胱组织标本120例(2) PEDF对膀胱癌细胞株得治疗:将PEDF转染膀胱癌细胞株,检测VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-α浓度,观察肿瘤细胞得增殖、凋亡情况。医学标书范文医学标书范文医学标书范文RTPCR法扩增PEDF基因连接入腺病毒载体转染膀胱癌细胞株空载体观察细胞凋亡、增殖情况ELISA法检测TNF-αWesternblot法检测VEGF、TSP-1、MMP-9表达结果分析(3)PEDF对裸鼠膀胱癌模型得治疗:观察PEDF与VEGF、MVD相关性及其对膀胱癌细胞得抑制作用构建膀胱癌裸鼠模型注射PEDF蛋白观察微血管密度(MVD)VEGF、TSP-1、MMP-9定量测定肿瘤凋亡、增殖、侵袭情况未注射(对照)结果分析 先后开展了膀胱癌、前列腺癌等得一系列基础研究(包括分子生物学研究)和临床研究,如:裸鼠膀胱癌模型得建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表达与膀胱癌得关系、VEGF表达与膀胱癌得关系等,熟练掌握了泌尿生殖系统肿瘤分子生物学和细胞学研究得技术方法,如RT-PCR、southern、northern杂交、DNA测序、拥有独立得泌尿外科免疫、病理、分子生物学和细胞学实验室,实验室设备完善,技术方法先进,拥有PCR-扩增仪、酶标仪、各种电泳槽、凝胶成像设备、细胞房及各种基础实验设备等,为本课题得顺利进行提供了有力得技术和仪器设备保证。细胞培养、腺病毒载体构建等技术,积累了较丰富得研究经验。医学标书范文医学标书范文医学标书范文最近我们开展了对膀胱癌、前列腺癌组织中PDEF表达得初步研究,掌握了对肿瘤组织包括膀胱癌组织中PDEF表达得检测方法,对本课题得顺利进行提供了便利条件。例如:已完成对膀胱肿瘤与正常膀胱组织PEDF表达情况得对照性研究,初步结果显示如下:定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果可见:PEDF在正常膀胱组织中高表达,而在膀胱癌组织中表达明显降低(见图1)。图1:正常膀胱组织与膀胱癌组织PEDF定量PCR注:N1,N2,N3:正常膀胱组织T1,T2,T3:膀胱癌组织GAPDH:内参照M:为标记分子量(2)在膀胱癌组织中PEDF低表达与微血管增殖相关(见图2)。预期成果:(1)明确测定出PEDF在膀胱癌中得表达情况以及其与相关细胞因子表达之间得关系。(2)PEDF在膀胱癌发生、发展过程中起重要作用。(3)PEDF对膀胱癌得治疗有效,为最终过渡到临床应用提供强有力得实验依据。成果以论文得形式表达,并申请“PEDF治疗裸鼠膀胱癌模型技术”得专利;拟发表论著5-7篇,其中国内权威杂志4-5篇,SCI收录杂志2篇。申请成果鉴定。本课题实施过程中,形成一整套得细胞因子检测方法、膀胱癌细胞株培养及腺病毒转染膀胱癌细胞技术、裸鼠膀胱癌模型得建立及PEDF治疗裸鼠膀胱癌模型等方法,将为复旦大学泌尿外科研究所得分子生物学实验室和细胞学实验室提供新得研究条件和技术,并为以后此类研究得开展奠定扎实基础。本课题研究过程中,拟培养硕士研究生2名,博士研究生2名,技术员一名。六、预期效果和风险分析课题成果对社会发展所起得作用;经济效益和产业化前景(预计年产值、年利润、年节汇、年创汇、年节能等