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入镜头之内,使视野更暗;若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类,如柏木油等,则光线不会因折射而损失太大,可使视野充分照明,能清楚地进行观察和检查。三、油镜的使用方法:进行油镜检查时,应先对好光线,但不可直对阳光,采取最强亮度(升高集光器,开大光圈,调好反光镜等)。然后在标本上加柏木油一滴(切勿过多),将标本放置或移置载物台的正中。转换油镜头浸入油滴中,使其几乎与标本面接触为度(但不应接触)。用左眼由目镜注视镜内,同时慢慢转动粗螺旋,提起镜筒(此时严禁用粗螺旋降下油镜筒),至能模糊看到物像时,再转动微螺旋,直至物像清晰为止。另一种是固定镜筒调节载物台的显微镜,调焦时,镜片先与油镜头接触,再慢慢转动粗螺旋,将载物台往下调,能模糊看到物像时,再转动细螺旋,直至物像清晰为止,随即进行检查观察。油镜用过后,应立即用擦镜纸将镜头擦拭干净。如油渍已干,则须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶解并拭去油渍,然后再用干擦镜纸拭净镜头。四、细菌是单细胞生物,尽管个体微小,但有其完整的形态特征和结构。细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外,尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜、质粒等附属结构。五、真菌是一大类不含叶绿素,无根、茎、叶,由单细胞或多细胞组成的真核细胞型微生物。在自然界分布广、数量大、种类多。主要营腐生和寄生生活,且真菌体内含有丰:..富的酶系统,能分解各类复杂的有机物质,所以在有机物存在的阴暗、潮湿的地方均能看见真菌的踪迹。并且在物质循环中也起着重要的作用。大部分真菌对人类有益,但有些真菌可引起人和畜禽疾病,有些霉菌还产生***,直接或间接地危害人类和动物健康。[实验材料]1、标本:大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌(培养物片及组织片)、变形杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、酵母菌的染色标本。2、仪器及其他物品:普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。3、菌体待检霉菌。4、培养基沙堡培养基。5、仪器及其他物品显微镜、恒温箱、载玻片、盖玻片、染色液、湿盒、霉菌(青霉、曲霉、毛霉)标本片等。[实验内容]1、用低、高倍镜观察酵母菌(1)将低倍物镜(10×)转到工作位置。上升聚光器,将光圈打开,转动反光镜采集光源,使视野明亮。(2)将标本片放于载物台上并上升载物台到最高。(3)转动粗调节螺旋,当目镜中看到模糊物像时再转动细螺旋直至物像清晰为止。观察酵母菌的形态特点。(4)高倍镜观察:用手按住物镜转换器慢慢旋转将物镜转换成高倍镜(40×),转动细调将物像调至清晰,进行观察。2、用油镜观察细菌标本片(1)用10×镜对光,使视野明亮(2)在标本片观察部位滴加少量香柏油后放于载物台上,转换物镜为油镜。缓慢上升载物台使油镜浸入香柏油中,并从侧面观察,使镜头上升至既非常接近玻片又不与玻片相撞的合适位置,避免压碎镜头晶片。(3)缓慢下降载物台,同时从目镜中观察,直至出现模糊的物像时再用细螺旋调至物像清晰为止。观察细菌基本形态及特殊构造。3、显微镜用后的处理(1)处理玻片加2-3滴二甲苯于标本片上,使香柏油溶解,再用擦镜纸擦净保存供以后使用。(2)清洁显微镜先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,再用蘸有二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油,最后用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯;清洁目镜和其他物镜,可直接用干净的擦镜纸擦净;用柔软的绸布擦净机械部分的尘土。最后将物镜转成“八”字式,下降载物台,聚光器降至最低位置,反光镜镜面转成垂直状。4、待检霉菌在固体培养基上的生长表现霉菌在固体培养基上的生长表现将不同霉菌在固体培养基上培养2~5d,可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异,有的能扩展到整个固体培养基,有的有一定局限性(直径1~2cm或更小),很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素,致使菌落表:..面、背面甚至培养基呈现不同颜色,如黄色、绿色、黑色、橙色等。5、霉菌标本片的观察6、霉菌小培养(载玻片法)的制作挑取待检霉菌孢子到盛有灭菌水的小试管中,,用无菌接种环勾取1-2环孢子悬液于载玻片中央,用灭菌滴管吸取灭菌后融化的沙堡弱氏培养基少许,滴于孢子悬液上,并迅速将盖玻片加在培养基上,轻轻压一下,压成直径1cm左右的圆形。将制好的片子放入到湿盒中,放在适宜温度的培养箱(28℃)3d后取出,室温再培养2-3d。7、待检霉菌的形态观察及鉴定将培养好的小培养片取出,镜下观察其基本形态。[实验结果预测]实际操作后,了解了光学显微镜的简单构造原理、使用方法和保护要点。可以熟练掌握油镜的使用方法。并分别观察到细菌、真菌的基本形态如下:细菌基本形态真菌基本形态[实验分析]油镜观察过程当中,由于油镜放大倍数很高,镜片又是最小的,因此光线本身就比较暗,所以要加入和玻璃折光系数接近的香柏油,避免光线折射而产生的光线损失。细菌是单细胞生物,尽管个体微小,但有其完整的形态特征和结构。细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外,尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜、质粒等附属结构。真菌是一大类不含叶绿素,无根、茎、叶,由单细胞或多细胞组成的真核细胞型微生物。[实验改进意见](1)在标本片上滴加香柏油时要注意将香柏油滴加在经过染色后的标本颜色较深区域。(2)实验前先明确哪个是油镜头,转换成油镜头后,首先从侧面观察(而非从目镜观察),同时上升载物台至加有香柏油的载玻片进入镜头当中,即油滴和油镜头恰好接触即可。[思考题]1、当物镜由低倍转到油镜时,随着放大倍数的增加,视野的亮度是增强还是减弱?应如何调节?当物镜由低倍转到油镜,随着放大倍数的增加,显微镜目镜立刻的视野亮度是减弱的,焦距很短的时候才用油镜。可以增加辅助光源的亮度来调整视野亮度。:..2、使用油镜应注意哪些问题?(1)在使用油镜之前,必须先经低、高倍镜观察,然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。(2)将集光器上升到最高位置,光圈开到最大。(3)转动转换器,使高倍镜头离开通光孔,在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油,然后慢慢转动油镜,在转换油镜时,从侧面水平注视镜头与玻片的距离,使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。(4)用左眼观察目镜,并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找,在加油区之外重找时应按:低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按:低倍一油镜程序,不得经高倍镜,以免油沾污镜头。(5)油镜使用完毕,先用擦镜纸擦一遍,再用沾少许二甲苯的擦镜纸将镜头上和标本上的香柏油擦去,最后再用干擦镜纸擦干净。油镜是实验室常用的显微镜之一,清晰度略高于普通光学显微镜,用于观察衣原体,细菌,细胞器等较细微的结构。3、要使视野明亮除调节光源外,还可采取哪些措施?加大聚光器光圈,调节光源亮度。同样设置下低倍物镜比高倍物镜视野亮。4、描述常见霉菌的形态特征和培养特性。形态特征:霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝构成。菌丝是真菌营养体的基本单位。菌丝是中空管状结构,直径一般3~10m,有分枝,有隔膜或无隔膜。根据菌丝有无隔膜,可以将真菌分成低等真菌(鞭毛菌亚门和接合菌亚门)和高等真菌(子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门)两大类。许多菌丝分枝连接,相互交织在一起所构成的形态称菌丝体。液体培养特性:如果是静止培养,菌丝往往在液体表面生长,液面上形成菌膜。如果是震荡培养,菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球,亦可形成絮片状,与震荡速度有关。实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。2、学****无菌操作,树立无菌观念。[实验原理]细菌细胞微小,无色而半透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须借助染色使菌体着色(由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用,染料能使细菌着色,并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应)后,使其与背景形成明显的色差,从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。根据不同的染色反应,可作为鉴别细菌的一种依据。微生物染料是一种带苯环的有机化合物,其分子上具有发色基团和助色基团。前者给化合物以特有的颜色,但不能与细菌结合;后:..者使化合物具成盐的性质,能和菌体结合。分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。根据细菌个体形态观察的不同要求,可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。革兰氏染色:。此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。是细菌学上最常用的鉴别染色法,有着重要的理论和实践意义。其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染,再加媒染剂-革兰氏碘液,以增加染料和细胞的亲和力,使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物,然后用脱色剂-乙醇脱色,最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者即为G+菌,反之,脱色后染上复染剂颜色(红色)者即为G-菌。其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同,通过染色加以鉴别。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚,交联而成的肽聚糖网状结构致密,且类脂质含量少,经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小,通透性降低,结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色,结果细胞呈现紫色。而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄,网状结构交联少,而且类脂质含量较高,经乙醇处理后,细胞壁孔径变大,通透性增加,结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁,结果细菌被脱色,再经沙黄复染后呈现红色。[实验材料]1、菌种:大肠杆菌、葡萄球菌的斜面培养物和肉汤培养物各一管。2、材料:载玻片、接种棒、酒精灯、打火机、吸水纸(滤纸本)、无菌水、染色缸、香柏油、二甲苯等。3、染色液:草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄染色液。4、仪器:显微镜[实验内容]1、细菌涂片的制备(1)玻片准备载玻片应清晰透明,洁净而无油渍,滴上水后,能均匀展开,附着性好。如有残余油渍,可按下列方法处理:滴95%酒精2~3滴,用洁净纱布揩擦,然后在酒精灯外焰上轻轻拖过几次。也可提前将玻片浸泡在95%的乙醇中预先脱脂备用。(2)涂片针对所用材料不同,涂片方法也有差异。(如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等)可直接用灭菌接种环取一环材料,于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。(如菌落、脓、粪便等)则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水,置于玻片中央,再用灭菌接种环取少量材料,在液滴中混合,均匀涂布成适当大小的薄层。,然后以灭菌或洁净剪刀取一小块,夹出后将其新鲜切面在玻片上压印(触片)或涂抹成一薄层。如有多个样品同时需要制成抹片,只要染色方法相同,可在同一张玻片上有秩序地排好,做多点涂抹,或先在玻片上划分成若干小方格,每方格涂抹一种样品并做好记录。(3)干燥上述涂片应让其室温自然干燥。(4)固定有两类固定方法:火焰固定(物理固定):将干燥好的抹片,使涂抹面向上,以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次,略作加热(但不能太热,以不烫手为度):..涂片固定的目的有如下几点:(1)除去涂片的水分,涂抹材料能很好地贴附在玻片上,以免水洗时易被冲掉。(2)使涂片易于着色或更好地着色,因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强。(3)可杀死涂片中的部分微生物。必须注意,在涂片固定过程中,实际上并不能保证杀死全部细菌,也不能完全避免在染色水洗时不将部分涂片冲脱。因此,在制备烈性病原菌,特别是带芽孢的病原菌的涂片时,应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身,以免引起病原的散播。2、革兰氏染色(1)初染:将玻片置于染色架上,加草酸铵结晶紫溶液(量以覆盖满涂抹面为宜),染1-2min,倒去染液水洗。(2)媒染:加革兰氏碘液,染1-2min,水洗。(3)脱色:加95%乙醇,将玻片轻摇几下即倾去乙醇,如此重复几次,直至乙醇液不呈现紫色时停止,约20-60秒,立即水洗。(4)复染:滴加沙黄染液,染1-2min,水洗。3、镜检将染色好的玻片夹入滤纸本中,吸去水分。滴加香柏油后油镜观察。4、实验完毕后处理(1)清洁显微镜(2)玻片处理高压灭菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干备用。[实验结果预测](1)金黄色葡萄球菌图一金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10×100如上图所示,金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果为紫色,是革兰氏阳性菌(G+)。注:从图中可以观察到葡萄球状的细菌聚集状态。:..2)大肠杆菌图二大肠杆菌革兰氏染色结果,10×100如上图所示,大肠杆菌革兰氏染色结果为红色,是革兰氏阴性菌(G-)。(2)革兰氏染色观察结果列表菌种鉴定结果细菌颜色细菌形状(形状和聚集状态)金黄色葡萄球菌G+(阳性)紫色球状菌,葡萄球状聚集大肠杆菌G-(阴性)红色短杆状菌,分散排列[实验分析]通过本次实验顺利掌握了细菌涂片的制备方法及革兰氏染色的具体操作。虽然对于大肠杆菌菌液的装片,最终还是没有在镜下找到细菌,但通过固体平板上的大肠杆菌装片,还是看到了大肠杆菌的染色结果。[实验改进意见]实验操作发现,在涂片固定过程中,实际上并不能保证杀死全部细菌,也不能完全避免在染色水洗时不将部分涂片冲脱。因此,在制备烈性病原菌,特别是带芽孢的病原菌的涂片时,应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身,以免引起病原的散播。[思考题]1、为什么必须用培养24h以内的菌体进行染色?培养24小时以内的菌落处于生长活跃期,各项生理指标都正常。对于时间较长的菌落,由于细胞老化,胞壁成分发生变化,部分阳性菌会出现假阴性,即染色结果为红色,这样会导致错误。2、革兰氏染色中最关键的一步是什么?如何控制这一步?革兰氏染色中脱色最关键,因为乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节:脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌;脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般控制为20-30s。:..自然界中微生物的分布[实验目的]1、了解周围环境中微生物的存在和分布状况。2、了解无菌操作在微生物实验中的重要性。[实验原理]在我们的周围环境中存在着大量微生物,其种类繁多、形态多样、数量庞大。它们不但广泛分布于室内外的空气、水和土壤中,还分布在我们生活环境中的所有物品上。土壤是微生物栖居的“大本营”,它含有的微生物种类和数量最多;有些微生物附着于尘埃上漂浮于大气中,此外,人和动物体的口腔、呼吸道和消化道及动、植物体表面都存在着各种微生物。可以说,微生物是无孔不入、无处不在的。由于微生物个体微小、结构简单和肉眼难以观察,如果将这些微生物通过某种方法接种到合适它们生长的营养基质上,在适宜温度下培养后可形成肉眼可见的细胞群体,此即为菌落。通过平板培养的方法可检查环境中微生物的数量。不同种的微生物可形成大小、形态各异的菌落,其可作为细菌种属鉴定的依据。[实验材料]1、样品土壤,自来水,污水,实验室或其他地方室内空气,物体或桌面表面,***肤表面等。2、培养基无菌普通琼脂平板、无菌普通营养琼脂瓶。3、仪器和其他物品培养箱、酒精灯、试管架、水浴锅、无菌生理盐水(10mL、9mL、5mL),无菌吸管(1mL),无菌空平皿等。[实验内容]1、标记用记号笔在培养皿底部标记样品名称、组别、日期等内容或写在标签纸上,贴于皿底一侧,避免影响结果观察。2、空气中微生物的检测选择适当位置,打开无菌平板的皿盖,使培养基暴露于空气中一段时间,即让空气中含微生物的尘埃或颗粒以沉降法自然接种到培养基表面。分别经20min、60min后盖上皿盖,37℃24h培养。可选择同一地点不同时间或不同地点同一时间的不同方式。3、皮肤表面的细菌检测取无菌平板一块,一分为三。一侧用手指直接在培养基表面涂抹,洗手后再在另一侧涂抹,盖好皿盖。酒精棉球消毒后用手指直接在培养基表面涂抹,37℃24h倒置培养。4、桌面的细菌检测取无菌平板一块,用无菌棉签在5mL盐水管中浸湿后直接在培养基表面涂抹,盖好皿盖。37℃24h倒置培养。5、土壤中细菌的检测取约1克土(离地表10cm处)于9mL无菌生理盐水中,混匀。静置10min后,吸取1mL悬液于无菌空平皿中,倾注,凝固后37℃24h倒置培养。6、水中微生物的检测分别