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引言大黄鱼的基本概况大黄鱼(Larimichthyscrocea)隶属脊索动物门(Chordata)、脊索动物亚门(Vertebrata)、硬骨鱼纲(Osteichthys)、鲈形亚目(Percoidei)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys),我国东南沿海是其主要的栖息地,属于我国海洋主要经济鱼类之一,被誉为中国“海洋四大经济鱼类”[1]。福建省宁德市是我国大黄鱼产业的发源地,也是规模最大的养殖基地,根据全国渔业年鉴统计数据表明,,,%[2]。从20世纪80年代大黄鱼人工繁育实现技术突破后,大黄鱼网箱养殖得到迅速的发展,如今,大黄鱼已经成为我国养殖规模最大的海水养殖鱼类[3]。但随着养殖规模的不断扩增,导致养殖区生态环境日益恶劣,再加上经长期的人工繁育导致大黄鱼的许多优良性状逐步的退化,机体免疫力下降等原因,致使其各种各样的病害频发[4]。在诸多病害中,以细菌病和寄生虫病居多,细菌病因其发病率高,流行范围广,防治困难,危害最为严重,成为限制大黄鱼养殖健康发展的重要因素[5]。(immunoglobulin,Ig)是抗原物质刺激机体的免疫B细胞,使其转变为成熟浆细胞,浆细胞经过一系列的反应产生能和相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。鱼类的免疫球蛋白研究表明,目前在硬骨鱼类中已经分离得到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT[6]。硬骨鱼血液和黏液中最主要的一类免疫球蛋白是IgM,它是最早被发现的[7],而随后发现的其他两类免疫球蛋白含量较低[8-10]。IgM发现最早、研究最多,其为四聚体分子,重链具有较高的保守性[11],重链的分子量大小在70kD左右,轻链的分子量大小在30kD左右。它起着重要3的作用,在机体防御早期,结合在B细胞表面作为B细胞受体或者分泌到体液中行使抗体功能[12]。另外,在没有受到明显的外源抗原刺激时,在鱼体内也有天然抗体的存在,这些天然抗体在固有免疫和获得性免疫应答中起重要作用[13]。鱼类血清IgM可用于制备单克隆抗体、多克隆抗体等,用于鱼类免疫应答研究。(polyclonalantibody,pAb)是指机体受一类含有多种抗原决定簇的抗原刺激,使机体的免疫细胞产生能与这些抗原特异性结合的抗体,所得到的抗血清是多种抗体的混合物。多克隆抗体具有制备的时间周期短,成本低,与抗原特异性结合能力强等优点,因此在各方面的应用也是十分的广泛。,产生对应抗原的抗体。其制备的过程是按照免疫的标准流程,将体外的抗原和佐剂混合成乳状液后注射进入健康的动物体内,经过多次的注射后,使得免疫动物的体内产生能与此抗原特异性结合的抗体,取免疫动物的血液经过离心得到的血清就是抗该特定抗原的抗血清。多克隆抗体的制备就是利用动物机体的免疫系统,当外界抗原进入体内,刺激相应的免疫细胞生产抗特定抗原的抗体,得到的抗体可特异性识别相应的抗原。,因此多抗效价的测定必不可少。(1)多克隆抗体的效价测定目前,被广泛应用于多抗效价测定的方法是酶联免疫吸附实验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)。ELISA方法基于抗原、抗体特异性结合和酶的高效催化作用相结合的基础上,将抗原或抗体固定在以聚苯乙烯为材料酶标板上,每加入一种抗原或抗体孵育后,为了使试验结果具有较高的准确性,减少一定的误差,都应将剩余的游离反应物洗涤除去,最后与酶标记的抗体反应,加入酶的底物催化生成有色物质,进行定性定量的检测。自ELISA方法出现以来之所以得到了广泛应用,是因为其实验方法具有敏感、快速、操作简便等的优点。3在实际应用中,往往根据检测物质的差异,选取相应的检测方法,用间接法、双抗体夹心法和竞争法分别检测抗体、抗原以及小分子抗原或半抗原。(2)多克隆抗体的结合特性分析制备的多克隆抗体的结合特性的分析方法是多种多样的,免疫印迹法(Westernblotting)之所以是检测蛋白结合的常用方法之一,是因为其具有较大的分析容量、较高的检测敏感度、较强的结合特异性等的优点。免疫印迹法是一种将凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术。该技术在生物化学上也被广泛应用于病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定及组织抗原的定性定量检测等。李再禹[14]等人认为随着生物技术的飞速发展,应用免疫印迹等技术分析致病菌的毒力蛋白,是生物技术领域制备疫苗的一个理想途径;根据抗体通过抗原决定簇识别抗原的机理,Rachkov和Minoura[15]发展了另一种免疫印迹法,以蛋白质表面暴露的一小段短肽为模板进行印迹的抗原决定基印迹,得到的印迹材料对模板肽段和蛋白同时具有识别作用;朱丽英和肖卿玉[16]等人利用免疫印迹技术成功鉴定了3个可能的乳腺癌相关抗原;胡翠华和张传宝[17]等人利用免疫印迹技术对癌胚抗原进行了鉴定;郑磊[18]等人利用免疫印迹和间接ELISA证明兔抗美洲黑石斑鱼血清IgM多克隆抗体能与美洲黑石斑鱼血清IgM特异性结合。,多克隆抗体的应用主要在抗体活性和抗体水平的变化方面的检测,也用于检测特异性抗体在机体内的分布以及抗体表达变化量等的方面。而制备抗血清免疫球蛋白的多克隆抗体主要应用于检测血清免疫球蛋白活性,也帮助理解血清免疫球蛋白的结构类型及生理生化功能,为阐述其在机体内如何进行免疫提供基础,也作为一种对重大疾病进行早期判断和疫苗效果进行评价的工具。同时,为了研究鱼类血清中抗体在不同时期的变化水平,并对鱼类疾病进行早期判断诊疗和研制疫苗效果的进行评价工具,越来越多的鱼类血清免疫球蛋白多克隆抗体被制备。陈垚[19]等人通过制备兔抗鲫鱼血清IgM的多克隆抗体,制备出兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体亲和柱,为分离纯化皮肤粘液的IgM做准备,并为之后进一步研究鲫鱼免疫系统等奠定基处。丁炜东[20]等人通过制备兔抗草鱼血清IgM多克隆抗体;刘振兴[21]等人通过制备兔抗黄鳍棘鲷血清IgM多克隆抗体;郑磊[18]等人通过制备兔抗美洲黑石斑鱼血清IgM多克隆抗体,并为进一4步研究草鱼、黄鳍棘鲷和美洲黑石斑鱼的免疫系统和免疫机理及相关免疫检测研究奠定基础。鄢庆枇[22]等人通过制备兔抗大黄鱼血清IgM多克隆抗体的制备,为进一步理解大黄鱼免疫系统,为研究大黄鱼的免疫机理及相关免疫检测奠定基础。,选取Balb/c品系小鼠,按照标准免疫流程,制备了鼠源大黄鱼血清IgM多克隆抗体,运用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定鼠抗大黄鱼血清IgM的效价,免疫印迹(WesternBlotting)方法对制备的鼠多抗的结合特性进行了分析。研究内容有助于加深对大黄鱼免疫系统的理解,也将为研究大黄鱼的免疫机理以及相关免疫检测奠定基础。-8周(16-30g)Balb/C雌鼠购于吴氏实验动物公司。-1实验仪器与设备仪器型号厂家多功能超纯水系统Unique-S20厦门锐思捷电泳仪电源DYY-6C型北京六一高速离心机3K15Sigma分析天平BSA-124SSartorius电子天平YP802N上海精科高压灭菌锅GR60DAZEALWAY制冰机AF100-ASSartorius精密可程式烘箱BXH-65上海博讯5表2-1实验仪器与设备(续)仪器型号厂家电冰箱BCD-225WDGK青岛海尔医用冷藏箱HYC-310青岛海尔抽滤系统ChemicalDutyMillipore水平摇床Ts-8型其林贝尔pH计Pb-10Sartorius蛋白质纯化系统GEAKTAPureAmersham电泳装置Mini-ProteincellBio-Rad冷冻干燥机YB-FD--2实验试剂试剂名厂家弗式完全佐剂Sigma弗式不完全佐剂Sigma2×ProteinSDS-PAGELoadingBufferTaKaRaTrisSolarbioGlycineSolarbioSDSSolarbio碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠Ig抗体SigmapNPP上海生工BSASolarbioBCIP/(PBS)、磷酸盐吐温缓冲液(PBST)、5%牛血清白蛋白溶液(BSA)、pNPP发色液(现配现用)、pNPP缓冲液、-HCl()、-HCl()、蛋白电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250染液、电转移缓冲液及丽春红染色液等。、ProteinA柱亲和纯化及透析冻干后,以少量PBS重悬,经Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定浓度约2mg/mL。PBS将纯化蛋白调整至浓度约1mg/mL后,分4次分别免疫Balb/c小鼠。(1)基础免疫:将纯化后大黄鱼血清IgM与弗氏完全佐剂1:1混合,用注射器混匀使其形成“油包水”乳化剂,以液体滴入清水中10s不散时为准,充分乳化后用无菌注射器腹腔注射小鼠,。(2)加强免疫:两周后进行第1次加强免疫,纯化后大黄鱼血清IgM和弗氏不完全佐剂1:1混合,用注射器混匀使其形成“油包水”乳化剂,以液体滴入清水中10s不散时为准,采用腹腔注射小鼠,。第四周和第五周各再加强免疫1次,,无佐剂。(3)抗血清的制备:最后一次加强免疫的一周后,运用摘眼球的方法一次性取血,在室温中倾斜放置2h,后放置在4℃冰箱过夜;次日8000rpm离心10min获得鼠抗血清。(每只小鼠取全血约1mL,)[23]论文多抗效价测定方法,采用间接ELISA的方法,按照抗原包被、BSA封闭、一抗孵育、酶标二抗孵育及发色等步骤测定多抗效价。7(1)包被抗原:取5~20μg/mL的大黄鱼血清IgM蛋白溶液作为抗原加入酶标板中,每孔100μL,4℃包被过夜。(2)封闭:包被完成后,弃去包被液,小心甩干残留液体,用排枪加入每孔280μLPBST洗三次,每次5min。甩干孔内液体,每孔加入200μLBSA,37℃封闭1-2h。(3)一抗孵育:封闭完成后,弃去封闭液,用PBST洗三次,每次5min,甩干残留的液体。将小鼠抗大黄鱼IgM的血清梯度稀释500倍、1000倍、2000倍、4000倍、5000倍、8000倍、10000倍、20000倍、30000倍、40000倍、50000倍、100000倍,依次加入酶标板中,每孔100μL,对照孔用等量健康小鼠血清代替,37℃孵育1h。(4)二抗孵育:一抗孵育完成后,弃去孵育液,用PBST洗三次,每次5min,甩干残留的液体,向每个孔中加入AP标记的羊抗鼠Ig的二抗100μL,37℃孵育1h。(5)发色:二抗孵育后,弃去孵育液,PBST洗三次,每次5min,甩干残留的液体,用排枪向每个孔中加入pNpp发色液100μL,现配现用,置于酶标仪中,405nm处连续读数,~,计算P/N值,以P/N≥,结果为阳性时的最大稀释倍数即为血清效价。(Westernblotting)的方法。该方法首先将亲和纯化的大黄鱼血清IgM经变性聚丙烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,转移至PVDF膜;随后用制备的鼠抗大黄鱼血清IgM的多抗作为一抗,AP标记的羊抗鼠Ig作为二抗进行免疫反应,最终NBT-BCIP发色液进行发色。具体步骤如下:SDS-PAGE分离亲和纯化的大黄鱼血清IgM①制胶:按表2-3比例配制分离胶和浓缩胶,首先配好的分离胶倒入组装好的玻璃夹层中,液面到达玻璃夹层的2/3以上,为了保持凝胶的平整,上部用蒸馏水进行水封。待分离胶凝聚后,倾出分离胶上面的蒸馏水,用剪切好的小滤纸将多余的水分吸出,注意不要碰到分离胶。其次向玻璃夹层内加入浓缩胶直至溢出。最后插入点样梳,待浓缩胶凝聚后,轻轻地拔去点样梳。