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实验室需要及时升级更新。因此,NGS实验室必须出具相关政策方案,用来定期检测和更新在实验过程中的仪器、化学溶剂、试剂。NGS实验中所用到的最新的文库构建、扩增、测序的方法是被实验室所验证过的,能够有效的提升数据质量的重复性和实验的准确性的。此外,方案中还需注明检测升级更新的方法,更新的实施时间〔每次更新的间隔时间〕以及在临床实际应用前的进一步验证方案。生物信息分析局部NGS数据相关生物信息分析可分成三个主要步骤:首先是产生记录碱基序列信息、碱基质量的FASTQ格式文件。FASTQ文件中,每4行显示一条read信息,包括碱基类型、标识符及碱基质量信息,FASTQ类型文件也是目前NGS领域中应用最广泛的信息储存类型;第二步是将检测获得的序列与参考基因组进行序列比对,以此检测病人序列与参考基因组序列之间的差异,之后将这些差异与基因、蛋白功能关联,进行注释;最后一步是将检测出的变异与病例表型信息相关联,筛选结果〔标注与疾病相关的稀有变异;基于家系做筛选〕并形成临床报告。结合NGS的临床诊断需要依赖于各种生物信息计算方法及软件,临床实验室在针对不同诊断应用时需要能够合理有效的选择相应的数据计算方法及生物信息分析软件。同时,对于这些算法和软件,实验室需要利用大量的样本来验证所用算法、软件在分析不同变异类型时的灵敏度、特异度以及重复性,以此来确认所用的生物信息学分析工具及参数是否符合标准,符合实验室要求及临床报告标准。一旦方法工具确认后,实验室也需要对运用于临床诊断的生物信息分析各步骤进行记录描述,并对这些步骤实施一个质量管理方案。Countycontinuationrecordshasexaminedandapprovedthedraft,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,、描述、及结果报告流程。实验室必须详细记录描述分析过程、结果报告中涉及到的所有算法、软件、数据库信息。分析流程中的这些软件、算法、数据库的版本必须是可查询且可追溯的。实验室必须明确详细的记录与默认参数不一致的自定义参数设置。在序列比对中,所用到的参考基因组序列版本号及组装的细节也需要详细记录在文件中。SOP文件中需要详细的描述NGS数据的整个生物信息分析流程,包括输入文件、输出文件及每步分析内容,并且描述每步过程中的质控条件及参数〔每条read的质控、碱基质量、测序深度、覆盖度〕。在后期数据筛选的流程及依据也需要表达在SOP文件中。NGS生物信息分析流程验证实验室必须对数据分析流程进行验证,并且当流程有修订的时候,必须要对整个分析过程进行重新验证,以检验修订后的流程其性能是否能够符合要求。重新验证的程度和范围依赖于修订的程度及范围。与NGS实验操作流程一致,实验室也需要利用一些包含变异的序列样本来验证整个数据分析流程的精确性、特异性、重复性。验证的样本数量依据不同平台决定,验证样本的选择可参考一些权威的样本数据,比方HapMap样本、遗传变异的细胞系或是之前分析过的临床诊断样本。注意一些高同源性序列的分析问题,如果需要分析这种类型的样本数据,实验室需要重新开发一个独立的测试方法。虽然NGS并不严格的要求确定变异分析中的假阳性率和假阴性率,但实验室需要针对不同变异类型,选取一些经典的样本数据来评估分析中假阳性和假阴性概率。假阳性可以通过利用不同种分析方法评估出来,而假阴性的评估那么会更加的复杂一些,假阴性可能由很多不同的因素产生,包括目标区段reads覆盖度不够、碱基检出的阈值设置太严苛、链特异性造成reads分布不均匀而未到达质控条件等。分析中参加一些目标区域外的对照区域,可能是一个很好的对照措施。在NGS实验建库过程中参加样本标签〔barcode〕是目前比较常做的事。但实验室需要确认标签序列在混池中的特异性,并且确认在分析的过程中,能够准确的识别区分出标签序列。在分析混池样本测序数据时,设置一个保存或过滤标签序列的标准是必需的。例如在分析过程中,只保存标签序列与建库时所添加的标Countycontinuationrecordshasexaminedandapprovedthedraft,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,。因此,可以通过检测标签序列是否完整来判断在混池过程中样本之间是否污染。整个分析流程也需要对肿瘤样本体细胞变异的检测灵敏度动态范围进行评估。这可通过对目标变异进行等浓度稀释的手段来进行评估。当整个分析流程有改动时,对流程的再次验证也是必需的。一个实用的再次验证方法那么是利用前期已验证过的数据,在设置新参数后,重新分析来检测分析的性能。NGS数据分析流程的验证及再验证的有效性依赖于完整的验证及再验证记录及临床应用的批准文件。NGS生物信息分析流程——质量管理体系实验室必须遵循质量管理体系来进行NGS生物信息分析临床实验室必需依据对应的质控标准来监测NGS数据常规分析工作,在分析过程中,任何与质控标准有偏离的地方都需要进行检查并制定对应的解决方案。偏差的情况如符合质控要求的reads数目太少;检测出的变异数目明显偏离预期;样本标签〔barcode〕序列被污染,导致检出的reads数显著增多。这些偏差都指示着实验过程中的误差或分析中的失误。因此,一个适宜的质量管理体系必须包括一个清晰的流程用以调查记录这些偏差,寻找原因,并建立适宜的修正策略,以及调查原因的方法步骤和实施的修正方案。生物信息分析流程——更新实验室需要有相关政策用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件算法的补丁修补、更新工作NGS生物信息分析中通常会运用多种有附加脚本和数据库的开放源代码软件包。考虑到这个领域不断的在更新进步,实验室必须有相关政策方案用以监测、记录及实施整个生物信息分析流程中相关软件包、数据库的补丁修补、更新工作,方案中还应该表达更新频率〔更新频率即表达更新的间隔时间〕,并进行详细记录。数据存储实验室需要在生物信息分析过程中对原始数据、中间数据及最后的结果数据的存储工作准备相应的方案NGS数据整个分析中会产生大量的数据文件,包括原始的芯片扫描文件,序列信息碱基质量的FASTQ文件,分析流程中产生的中间数据文件及进行变异检出的VCF文件。本检查表并不要求所有的文件都要长期存储Countycontinuationrecordshasexaminedandapprovedthedraft,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,实验室有决定权来决定在最后结果报告出来后什么类型的数据文件需要储存,以及储存的时间。NGSWorkGroup建议存储FASTQ文件或者是整理过的BAM/SAM文件,以便后期需要时对数据进行重新分析。需要注意的是,实验室在制定数据存储的方案时,需要符合当地政府对数据存储的政策要求。版本可追溯性每份病例数据分析报告中,生物信息数据分析流程所涉及软件、算法、数据库的版本都是可追溯的NGS生物信息分析流程中通常会涉及多种开放源代码软件包、脚本及数据库。每个软件或脚本的性能会直接显著的影响整个生物信息分析的效果。因此,对于每一份病例报告,实验室需要能够准确追溯其数据分析流程。对于自己开发的软件或脚本,如果有任何修改,实验室需要对其修改做好记录,但此记录不必表达在病例结果报告中。非常推荐实验室为每一套分析流程编制一个特定的、唯一的版本名称〔如:〕。如果整套分析流程中有软件包、脚本或数据库发生变动,或者是软件的配置参数发生变化,相应的版本号就需要重新编辑设定,并且整个流程需要平台重新验证。异常记录实验室需要建立一个异常记录文档,用来记录偏离NGS生物信息分析标准分析流程的具体情况整个分析流程中,如果有任何偏离数据标准分析流程的地方都需要被详细的记录下来,包括软件程序包、脚本、版本号、数据库、命令行或参数的任何变动。分析流程中出现的一些漏洞或纰漏也需要详细的记录在异常记录文档中,包括问题的描述、问题发生原因的调查、修正措施、相关的交流及直接负责人的批示。异常记录文档需要与相关的病例分析报告对应起来,而实验室主管也需要将这些与临床NGS数据分析SOP差异的地方与对应的临床医师进行交流。相关记录列入每月质量控制报告中。当分析一些特殊病例或基因组区间的时候,相对于SOP而言,整个分析流程中所涉及到的任何修改变动,对应的解释说明都需要表达在最终的结果报告中。NGS数据传输保密性政策Countycontinuationrecordshasexaminedandapprovedthedraft,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,spirit,prehensiveYearbookofzhuanglangalreadyprepareddraft,,除了会产生大量的特定基因/区域的序列数据外,还会包括很多病人的个人信息〔性别、出生年月、医疗记录、健康状态等〕,实验室必须建立一个严格的规章流程来确保这些个人信息的平安及隐秘,包括这些信息在不同实验室与第三方公司之间传递的平安性。政策中需要表达的内容比方:数据的加密、数据传输的平安性、对访问用户进行权限设置、访问记录及内容统计。ountability法规〔健康保险可移植性及责任与义务法规〕,例如与外部的供应商签订商业合同,说明其充分的权责用以确保临床样本基因组数据在传递和接受时的机密性。序列变异——结果解释及报告实验平台对测序分析变异结果的描述及报告需要遵循专业组织的建议与指导基于NGS技术,实验室可以进行各项不同的检测,小到单个基因检测,大到基因panel、外显子组或整个基因组。通过NGS技术,我们通常会检测到大量的之前未报道过的新变异位点或致病位点。目前,大