文档介绍：实验2 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
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ʺ实验目的
⃔了解蛋白质的两性解离性质
⃔学习测定蛋白质等电点的一种方法
⃔加深对蛋白质溶液稳定因素的认识
⃔了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义
2 SSB
₪蛋白结构改变可导致其溶解度发生改变
◆在pH>pI时,蛋白带负电,蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状
◆在pH<pI时,蛋白带正电,蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状态
ʺ实验原理
◆在pH=pI时,蛋白不带电,蛋白溶解度最低(注:不一定沉淀)
⃑⃑蛋白的可逆沉淀: 结构可以恢复(非变性)
⃑蛋白带电性质的改变所引起的溶解度发生改变
3 SSB
⃑⃑蛋白的不可逆沉淀: 结构不可以恢复(变性)
⃑蛋白经高温加热
⃑盐析和特定条件下的乙醇作用(低温和短时间)
⃑蛋白和重金属作用: 如硝酸银
⃑蛋白和某些有机酸作用:如三氯乙酸
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ʺ试剂和器材
₪试剂
& 新鲜鸡蛋
& %酪蛋白醋酸钠溶液
,加少量水在乳钵中仔细地研磨,将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内,用少量40-50℃的温水洗涤乳钵,将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中,并小心地旋转锥形瓶,直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内,加水至刻度,塞紧玻塞,混匀。
& 、 mol/L、 mol/L醋酸溶液
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&蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清:水=1:9)
& —醋酸钠的缓冲溶液 100mL
3%硝酸银溶液 10mL
5%三氯乙酸溶液 50mL
95%乙醇 250mL
饱和硫酸铵溶液 250mL
硫酸铵结晶粉末
300mL
300mL
300mL
甲基红溶液 20mL
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₪器材
水浴锅
温度计
200mL锥形瓶
100mL容量瓶
吸管
试管及试管架
乳钵
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ʺ实验操作
₪酪蛋白等电点的测定
& 取同样规格的试管4支,按下表顺序分别精确地加入各试剂,然后混匀。
试管号蒸馏水 mol/L醋酸 0. 1 mol/L醋酸 1. 0 mol/L醋酸 pH 混浊程度
(mL) (mL) (mL) (mL)
1 ——
2 — —
3 — —
4 ——
& 4支试管中各加4% 酪蛋白醋酸钠溶液1mL并马上摇匀。观察其混浊程度。静置10min后,再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
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₪蛋白质的沉淀及变性
▐蛋白质的可逆沉淀
盐析: 无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)能析出蛋白质。
Ø 加蛋白质溶液5mL于试管中,再加等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置数min,观察是否有沉淀,为什么?(沉淀为球蛋白)。
Ø 倒出少量混浊沉淀,加少量水,观察是否溶解,为什么?
Ø 将管内容物过滤,向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。观察是否有沉淀,为什么?(沉淀为清蛋白)。
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▐蛋白质的不可逆沉淀
&重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
Ø 取1支试管,加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL,再加3%硝酸银溶液1-2滴,振荡试管,观察是否有沉淀,为什么?
Ø如有沉淀产生。倾去上清液,向沉淀中加入少量的水,沉淀是否溶解?为什么?
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