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明显的展宽现象,这可能是由于TCA的结合,使SDS与蛋白质的结合量产生偏差,从而造成蛋白质所带电荷的不均一性,造成迁移率的不一致。5、我们认为在电泳时使用TCA对蛋白质样品的浓缩或除盐时,对于分子质量大的蛋白质,要慎重选择TCA。6、对小分子量蛋白质的浓缩,采用TCA时也有两点需要注意:一是用TCA沉淀后,尽量用***彻底抽提TCA;二是样品sun11:..处理后要尽快进行电泳分析,以免发生聚集及断裂,造成结果分析的不准确。sun12:..双向电泳一、储备液的配制:水化储液:尿素()()()2%,过滤后分装成50小管,每小管500uL,-20℃冰箱保存。1%溴酚蓝储液溴酚蓝1%1gTris-。30%T,%C聚丙烯酰***贮液:()丙烯酰***146g甲叉双丙烯酰***4g用超纯水定容至500mL,,使用棕色瓶于4℃冰箱保存。丙烯酰***的计算:T=(丙烯酰***质量+甲叉丙烯酰***质量)/总质量×100%=(丙烯酰***克数+交联剂克数)/总体积(ml)×100%C=甲叉丙烯酰***质量/(丙烯酰***质量+甲叉丙烯酰***质量)×100%=交联剂克数/(丙烯酰***克数+交联剂克数)×100%sun13:..C值高,孔径小,凝胶较硬;C值低,孔径大,适合跑蛋白质。-:Tris-Base()(大约加入8ml),加超纯水定容至500mL。4℃冰箱保存。10%SDS:SDS10g加超纯水至100mL,混匀后过滤,室温保存。电泳缓冲液:Tris-Base()25mM12g甘氨酸()()%4g加入超纯水4L平衡储液:-CL()()%(V/V)150mLSDS()2%(W/V)10g溴酚蓝储液(1%)%(W/V)1mL加超纯水至500mL,40mL分装,-20℃保存。二、临用前配置溶液sun14:..水化液:%%%1uL胶条平衡缓冲液A:平衡储液20mLDTT1%。胶条平衡缓冲液B:平衡储液20mL碘乙酰***%,避光配制。低熔点琼脂糖封胶液:%%10L(1%溴酚蓝)加热溶解至澄清,室温保存。10%过硫酸铵::..双向电泳三、操作步骤(一)第一向等电聚焦一向电泳的准备工作:1、使用清水冲洗胶条槽,并用牙刷认真刷洗胶条槽内槽以及正负两个电极,并使用StripHoLderCLeaningSoLution清洗胶条槽,之后用二级纯水冲洗干净,自然晾干,胶槽的盖子同样使用StripHoLderCLeaningSoLution清洗自然晾干或用吹风机吹干。2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化储液或用吹风机吹干,置室温溶解,配制水化液。3、使用brandford法测量蛋白样品的相对上样浓度,计算上样量(每种蛋白样品上样量为150ug)。将每种蛋白溶液的体积用水化液补充至250uL。震荡混匀样品后,以13200rpm4℃离心30min。4、使用酒精擦拭IPGphor的平板电极,以去除表面被氧化的部分,待酒精挥发完全之后备用。5、从冰箱取出-20℃冷冻保存的干胶条,于室温放置平衡10分钟。6、胶条槽平行的放在IPGphor的平板电极上,将处理好的样品均匀的加入到胶条槽中,取室温平衡的胶条,用镊子轻轻的去除预制干胶条的保护膜,分清胶条的正负极,胶面向下放入胶条槽中,胶条吸胀15min-30min。sun16:..双向电泳7、在每根胶条上加入1mL覆盖油,可继续吸胀30min,加入覆盖油的作用是防止胶条水化过程中液体的蒸发。8、将胶条槽的盖子盖上,设置等电聚焦程序。S130V12hS2500V1hS31000V1hS48000V64000VhS52000V保持10h选择胶条数量。9、聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。(二)第二向SDS-PAGE电泳灌胶1、用棉花蘸洗涤剂反复擦洗玻璃板,用双蒸水漂洗,自然晾干;2、装好玻璃板,并将玻璃板置于通风橱中,使用水平仪保证玻璃板架的水平。3、%的丙烯酰***凝胶两块(85mL)。×Tris(,)%SDS850uLAPS425uLTEMED30uLsun17:..双向电泳4、将溶液分别注入玻璃板夹层中,~1cm的空间,用水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。一般凝胶与上方液体分为三层后,表明凝胶已基本聚合。5、凝胶凝固后,保证胶面湿润,定时补充去离子水。6、配制胶条平衡缓冲液A。7、在桌上先放置干的滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在滤纸上,吸干胶条上的矿物油。8、将胶条转移至平衡管中,每管加入10mL平衡缓冲液A,胶面朝上放入平衡管中。置于摇床上平衡13min-15min。倒掉平衡液A,加入平衡液B,同上平衡13min-15min。9、从平衡管中取出胶条,用电泳缓冲液冲洗胶条三遍,胶面朝外贴在玻璃外板上,用琼脂糖凝胶封口,保证胶条下方不要产生任何气泡。10、放置15分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。11、在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。12、在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时恒流15mA/块胶,15min后改为30mA/块胶。13、。14、电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并在正极端切角以作记号。将二维胶放入固定液进行固定。四、注意事项:1、样品蛋白在裂解液、水化液中等含有尿素的溶解液中时,sun18:..双向电泳不得加热此种样品,避免尿素水解成乙***酸盐,造成蛋白氨基甲酰化,导致pI值的偏移。2、尿素储液存放时间过长,则可形成***酸盐,从而发生蛋白质的甲酰化。分装后的裂解液、水化液储存于-20℃,一旦取出溶解后不能再继续使用。3、电极纸垫:采用纸质滤纸片,剪成3mm宽,用去离子水润湿后再用滤纸吸出多余的水,保证滤纸片湿润而不是过于潮湿。将湿润的滤纸片置于胶条与电极之间,可以减少盐分对等电聚焦的影响。(如果采用此方法,等电聚焦的伏特小时数需延长10%)五、试剂说明:Manifold胶条槽:采用导热氧化铝陶瓷制成,散热迅速,避免“热点”出现。应采用中性PH值清洗剂清除胶条槽顽渍或已变干的蛋白残留可用热的(最高95℃)1%(w/v)SDS清除,加1%(w/v)DTT可完全去除粘附的蛋白,在清洗后用去离子水冲洗干净。等电聚焦温度要求精准,氧化铝陶瓷制品及peltier冷却板有效控制等电聚焦的温度。四***乙二***:TEMED,作为交联剂,蒸气对眼和呼吸道有刺激性。液体可致严重眼损害;对皮肤有刺激性,可致灼伤。平衡缓冲液:尿素(6M):与甘油(30%)共同作用以增加缓冲液的粘性降低电内渗效应。sun19:..双向电泳电内渗效应:在电场中固相PH干胶条上存在固定的电荷,干扰蛋白质从固相PH干胶条向第二向凝胶迁移。SDS:使蛋白变性并形成带负电荷的蛋白-SDS复合物。DTT:在胶条平衡中的目的是打断二硫键,使变性的非烷基化蛋白处于还原状态。IAA:通过烷基化反应,使蛋白质硫醇基团烷基化,在电泳过程中防止蛋白再氧化,封闭打断的二硫键的部位,使其不能相互连接。在电泳过程中蛋白质的再氧化会产生拖尾或其他假象,同时可以使残留的DTT烷基化,从而防止点拖尾或其他银染假象。sun20:..双向电泳染色一、银染:银染试剂:(每块胶):乙酸40%25mL乙醇10%:乙醇75mL硫代硫酸钠(NaSO):***%(临用前加入)%(临用前加入):sun21:..双向电泳乙二***%:银染步骤:1固定:使用固定液固定双向电泳胶,固定时间大于1小时,过夜也可。:倒掉固定液,加入敏化液,敏化半小时。:倒掉敏化液,加入纯水,水洗时每隔十分钟更换一次纯水,冲洗四次。:避光,加入银染液,银染30分钟。,纯水冲洗胶,洗掉附着在胶面和盒子上的***银。:加入显色液后,溶液变黄,置于摇床观察显色情况。保证显色效果一致,显色保证底色不要太深。:当胶上点全部显出后,倒掉显色液,加入终止液。迅速终止反应,并终止10分钟。,适当去除胶面的银颗粒,准备扫胶。二、考马斯亮蓝染色:考染试剂:染色液(200mL):%%100mLsun22:..双向电泳乙酸5%10mL纯水90mL脱色液(可直接使用纯水)%75mL甲醇5%%875mLsun23:..双向电泳蛋白来源差异:细菌蛋白:高核酸蛋白比,核酸去除占重要地位。真菌蛋白:有较厚的细胞壁,使用较强的裂解剂,比如活性高的破壁酶以及SDS等。细胞:培养基中盐分较多,使用蔗糖缓冲液(washingbuffer)冲洗植物组织细胞:蛋白量少,且蛋白酶活性高。常用沉淀蛋白的方法进行浓缩,也常用还原剂与蛋白酶抑制剂来防止蛋白修饰。sun24