文档介绍：实验一血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
一、目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作,了解电泳技术的一般原理。
二、原理
带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳:采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法,叫做醋酸纤维薄膜电泳法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成,它具有均一的泡沫样的结构,厚度仅12μm,有强渗透性,对分子移动无阻力,作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少,应用范围广,分离清晰,没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋由、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材
(2×8cm)
四、试剂
(,)
,,加水至1000m1。
含氨基黑10B ,甲醇50ml,冰醋酸10ml,水40m1。可反复使用。
含甲醇或乙醇45 m1,冰醋酸5ml,水50m1。
含无水乙醇7份,冰醋酸3份。
五、操作
:
用镊子取醋酸纤维薄膜一张(识别光泽面与元光溶面,并在一角做上记号),放在缓冲液中浸泡20min。
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把膜条从缓冲液中取出,夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体,然后将无光泽重面朝上平铺在玻璃扳上。将点样器放置于白磁反应板中的血清中沾一下,,这样即在膜条上点上细条状的血清样品。掌握点样技术,是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
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,使两个电极槽的液面等高,将膜条无光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上(滤纸桥是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁)。膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室,通电,调节电压90~100V,~,通电45~60min,~3cm时,关闭电源。
:
电泳完毕后,将膜条取下放在染色液中浸泡10min。
:
将膜条从染色液中取出后,在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止,可得色带清晰的电泳图谱。从正极端起,依次为:清蛋白、α1蛋白、α2球蛋白。β蛋白、γ球蛋白。如图2所示:
定量测定时,可将膜条用滤纸压平吸干,按区带分段剪下, NaOH溶液中,并剪下相同大小的无色区带,膜条作空白对照,迸行比色;或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3min后贴于洁净玻璃板上,干后,即为透明的薄膜图谱,可用光密度计直接测定。
实验二酪蛋白的制备
一、目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,。利用等电点时溶解度最低的原理,,酶蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后,便可得到纯的酪蛋白。
三、器材
四、试剂
%乙醇
3. -醋酸钠缓冲液
A液:
B液:
称有机纯醋酸(%),定容至1000ml
,B液1230ml混匀,-醋酸钠缓冲液。
:乙醇:乙醚=1:1(V/V)
五、操作
℃。边搅拌边缓缓加入预热至40℃的缓冲液,并调节pH之后,冷却至室温。以3000r/min离心10min。弃去上清液,得酪蛋白粗制品。
,3000r/min离心,弃去上清液。
,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液沉淀两次,最后再用乙醚沉淀两次,抽干。
,干燥后得酪蛋白纯品。
,计算含量,并与理论含量()相比求出实际得率。酪蛋白含量g/100ml:牛乳(g%)
得率=100%
实验三甲醛滴定法测氨基氮
一、目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、原理
水溶液中的氨基酸为两性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成—NH—CH20H,—N(CH2-0H)2等羟甲基衍生物,使NH3+放出的H+游离出来,这样就可用碱滴定放出的H+,测定氨基氮,从而计算出氨基酸的含量。