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境。URA3基因产物一方面为合成尿嘧啶所必需,同时又能催化5-flourooroticacid(5-FOA)转变为一种有毒物质。在Vidal等构建的酵母菌株中,URA3基因的表达受到含Gal4结合位点的启动子的调控,利用尿嘧啶的缺陷培育可以筛选出与“诱饵〞蛋白相互作用的蛋白质〔阳性筛选〕,而在添加了5-FOA的培育基中,存在蛋白质相互作用的菌株却会因***作用而死亡〔阴性筛选〕,只有发生了蛋白质间解离或局部解离的转化株才可以表现出抗性而存在。图另一种反向筛选系统为别离杂交体系(split-hybridsystem),在此体系中存在着两个报道基因。(TetR)的编码序列,其次个报道基由于His3,启动子区插入了tet操纵子序列。双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白,从而抑制了阳性筛选标志His3的表达,此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸养分缺陷型。而只有那些作用蛋白质间已发生解离或局部解离的转化株可以在组氨酸缺陷的培育基上生长。图反向双杂交体系作为双杂交体系的补充,在争论蛋白质相互作用中发挥着日益重要的作用。①在筛选蛋白质突变体时,反向双杂交体系能从大量突变体中直接筛选出导致蛋白质间相互作用减弱或消逝的突变位点,而传统的利用LacZ报道基因来筛选的工作量大,且带有盲目性。②反向双杂交能够觉察可导致蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其他小分子物质。③传统双杂交体系的假阳性问题来源于文库中的很多片段具有自动激活报道基因表达的活性。假设能够应用反向双杂交对文库进展“预去除〞,那么有可能大大减轻以后的假阳性鉴定的负担。⑵三杂交体系是在双杂交体系上开展起来的另一分支,主要用于争论多蛋白质复合体之间的相互作用。融合蛋白BD-X和AD-Y在酵母细胞核内表达时,同时有第三种蛋白质Z表达。X和Y不能直接发生相互作用,必需通过桥梁蛋白质Z,X和Y才能发生相互作用,从而激活下游报道基因的转录。图由于在单个酵母细胞中,传统的双杂交体系只能争论两个蛋白质之间的相互作用,所以,在争论蛋白质复合体时,由于没有复合体中其他蛋白质的作用,多肽链可能会暴露诞生理状态下为其他蛋白质所掩盖的某些位点,因此造成假阳性或假阴性的结果。而在三杂交体系中,参与表达受到调控的第三种蛋白质可以使蛋白质复合体的相互作用更符合生理状态。因此,三杂交体系是对双杂交系统的一个有益补充。以此为根底,甚至可以再构建四杂交体系和反向三杂交体系,以争论更广泛的蛋白质相互作用。同以往争论蛋白质相互作用的试验手段相比,双杂交系统具有独特的优势。融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进展,蛋白质有可能保持自然的折叠状态,类似其在体内生理状态下的状况,这是其他体外生化检验方法所无法比较的,因此与后者相比,它所证明的蛋白质间的相互作用将更加接近于体内的真实水平。双杂交系统最大的应用价值在于它可以筛选cDNA文库中编码与蛋白质特异作用的成分。这种筛选过程不但提醒了很多蛋白质之间的未知作用,而且有助于觉察很多基因。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生,不需要额外的纯化步骤;此外,它能检测到短暂的相互作用,目前已被广泛地应用于信号通路的争论。但是,酵母双杂交系统也存在一些局限性,包括:①它只争论在核内表达的蛋白质的相互作用,融合蛋白的构建可能会影响到蛋白质本身的活性或折叠状态;②假设特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生,那么不能检测到修饰后蛋白质的相互作用;③很多蛋白质与BD融合后,具有自激活效应,导致假阳性结果。噬菌体展现(Phagedisplaytechniques,PDT)噬菌体能在其外表表达一种融合蛋白,该融合蛋白包含外源肽段,可与抗体结合。通过免疫亲和纯化,“融合型〞噬菌体得到富集。将文库基因构建到噬菌体中,然后筛选出与特异抗体相互作用的蛋白质,这一过程就被称为“淘选〞。抗体通常固定在塑料盘上,不能结合的噬菌体被洗脱掉,而结合的噬菌体被保存了下来,,经过几个星期后,可以富集结合严密的肽段DNA序列。图13 1丝状噬菌体,如M、fd、f,在其外表大约有5个拷贝基因编码的被膜蛋白,因此异源的DNA序列可以插入到该基因中,得到多拷贝的融合蛋白,被称为“多价展现〞。而另一编码被膜蛋白的基因可以产生2,700个融合蛋白的拷贝。通常状况下,多价展现只局限于小肽段,由于插入大片段会影响被膜蛋白的功能和噬菌体的感染力。在争论蛋白质相互作用方面,噬菌体展现有以下几个方面的优点:①,该噬菌体可得到1,000倍甚至更多的扩增,几次循环后,可得到相互作用的序列。②可以构建大的噬菌体文库(109~1010),亲和纯化可在高浓度(>103Phage/ml)下进展。③通过转变洗脱步骤的严格性,来评价融合蛋白结合的特异性。但是,噬菌体展现方法也存在一些缺点:①多价展现中对于肽段大小的限制;②;③由于是体外试验,蛋白质在宿主细菌中有时无法正确折叠或修饰;④构建的融合蛋白会影响到蛋白质本身的活性。基于质谱的方法串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)串联亲和纯化技术(tandemaffinitypurifica-tion,TAP)是由Rigaut等人在1999年共同提出的一套别离复合蛋白的方法,该方法兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的别离鉴定供给了一条路径。串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被别离纯化蛋白的一端加一个TAP标签,该标签由IgG结合构造域(ProtA:葡萄球菌蛋白A)及一个钙调蛋白结合多肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)组成,构造域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点〔烟草花叶病毒蛋白酶切割位点〕隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因,温顺裂解细胞,猎取细胞抽提物,将抽提物参与IgG亲和柱,TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大局部非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白严密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最终纯化出高纯度的目的蛋白复合体。图此法的奇异之处在于设计了一个双重的分子标签,包括A蛋白、TEV蛋白酶切割位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上,然后在宿主细胞内表达融合蛋白,表达水平接近于靶蛋白的自然状态。可以与靶蛋白发生相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上,形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温育在一起,通过A蛋白复合体结合到IgG上。冲洗后,参与TEV蛋白酶,洗脱下复合体。在Ca2+存在的状况下,洗脱液与包被着钙调素的珠子温育在一起,复合体就结合到珠子上。进一步洗去杂质后,参与EGTA螯合,复合体脱落。SDS-别离复合体各组分,胰酶酶切后,进展质谱分析。高通量质谱蛋白质鉴定(high-throughprotmass-spectoometricproteinamplexidentification,HMS-PCI)使用一分子标签如FLAG标记靶蛋白,使融合蛋白在细胞内过量表达,通过免疫亲和〔FLAG抗体〕捕获到抽提物中靶蛋白形成的蛋白复合体,SDS-别离复合体各组分,胰酶酶切后,进展质谱分析。HMS-PCI与TAP的最大不同之处是融合蛋白在细胞内的表达水平不同。假设自然状态下靶蛋白在细胞内的浓度过低缺乏以分析时,可承受HMS-PCI。但是靶蛋白过量表达时,又会产生假阳性的结果。因此,不同的试验对象应选用适宜的试验方法。遗传学方法基因外抑制子抑制子的突变能局部或全部逆转原有突变,使之称为正常表型。如野生型蛋白质X、Y能发生相互作用,当X突变时,X*与Y不发生作用,而当Y也突变后,突变体X*和Y*又能重形成二聚体,恢复原有的相互作用。合成致死效应单个基因的突变不能产生致死效果,而两个基因同时突变那么会产生合成致死效果,证明这两个基因所编码的蛋白质在功能上可能是相关的。从相关的mRNA表达来推想在不同生理条件下检测mRNA水平,假设一些基因对于特定的条件有一样的转录活性,那么这些基因可归为一类。能够发生相互作用的蛋白质的基因在同一基因类群中富集。优点:①将转录组学与相互作用组联系在一起;②由于mRNA水平是在不同生理条件下测定,所包含的条件范围比其他技术更广;③由于涉及聚类算法,因而试验结果依靠于不同的算法和参数的选择。,那么它们在不同的基因组中的位置是保守的。选择的倾向性使一些基因的相邻性得到保存。在一个基因群中,基因是保存的,但其位置那么不肯定,进化选择的压力倾向使其相关功能的基因成簇。由此可以推想蛋白质的功能和相互作用。基因融合物种在进化过程中,选择压力使得一些基因融合在一起,它们能够同时被调整,而这些基因所编码的蛋白质在功能上往往是相互联系的。基于蛋白质分子空间构造的推测InterPreTS(proteininteractionpredictionthroughtertiarystructure)(patchanalysis)蛋白质相互作用的位点具有特定的性质,通过分析蛋白质构造外表的残基,可以推测蛋白质相互作用的位点。每个残基需要分析溶解性、疏水性、极性等6个参数,通过6个参数的计算,给出蛋白质相互作用的可能性。