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人类基因组打算〔HGP〕HUPO:人类蛋白质组争论组织(HUPO)基因组学争论的成就、缺陷1900孟德尔遗传定律1913绘制出第一张线式基因图谱1929提出DNA的化学成分和根本构造人类基因组打算“三大科技打算”人类基因组打算,(因其对预防治疗遗传疾病、破解人类遗传密码具有里程碑式的意义〕与曼哈顿***打算、阿波罗登月打算,被称为20世纪的人类自然科学史上三大科学打算。人类基因组作图的目的:目的是保证人类整个基因组的完整性。都是依据人类社会进展需要,为了更好的了解人类基因组成与预防某些未知领域的疾病而做出的图解分析素材。。遗传图谱、物理图谱、基因组图谱这三个图谱之间的相关性遗传图谱:承受遗传学分析的方法将基因或其他DNA分子标记在染色体相对位置上构建的连锁图。表示不同基因之间的相对位置,以及不同基因之间的相对距离!物理图谱:承受分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定基因组的实际位置所构建的位置图。遗传图谱与物理图谱的共同之处都是确定基因或DNA分子标记在染色体上的排列位置。基因作图〔genemapping〕是一种遗传学作图,用来定位染色体中特定的DN***段。是基因组争论的成果之一,主要分为以重组率为定位依据的遗传舆图,以及以DN***段实际位置为依据的物理舆图?从几个方面看构造基因组学和功能基因组学?以全基因组测序为目标的构造基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。?蛋白质组学与传统蛋白质化学的区分①蛋白质组学争论与传统蛋白质化学争论不同。传统蛋白质的争论主要针对单个蛋白质。蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为争论对象。〔多蛋白质系统〕②蛋白质化学包括争论蛋白质的构造和功能,通常涉及物理生物化学或机械酶学,蛋白质组学的内容是系统生物学,而不是构造生物学。③蛋白质化学争论工作通常包括完整序列测定、构造测定以及进展构造掌握功能的模型争论;蛋白质组学需进展简单混合物的分析,通过在数据库匹配工具下进展局部序列的测定。蛋白质组学争论的目的:确定全部的蛋白质蛋白质组学与基因组学争论技术上有什么区分?基因组学蛋白质组学环境静态动态数量少多能否扩增利用PCR扩增无法扩增检测技术利用互补链抗原抗体结合对象唯一不同实体蛋白质组学争论的内容分为几个方面?主要哪几个方面,争论内容① 蛋白质的分别与鉴定② 蛋白质互作或蛋白质复合体分析③ 蛋白质翻译后修饰争论④ 蛋白质功能鉴定⑤ 蛋白质复合体的构造分析其次章蛋白质组学的三大分支:表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、构造蛋白质组学表达蛋白质组学争论技术:蛋白质分别技术、质谱分析技术、基因表达的系列分析技术、微测序而技术等功能蛋白质组学争论技术:生物信息学分析、全基因组的蛋白质标签、基因敲除或删除、酵母双杂交、蛋白质芯片等构造蛋白质组学争论技术:X射线晶体衍射图谱法〔测定晶体中的蛋白质分子构象〕、核磁共振法〔测定溶液中的蛋白质构象〕蛋白质组学与基因组学的区分。① 蛋白质表达水平不能从mRNA表达水平来推测。② 蛋白质组与他的状态相对应。③上述区分的根本缘由是蛋白质组学争论对象比基因组学争论更简单,为什么?数量多、构造更为简单、是动态反响发育过程①蛋白质的组成及构造比基因更简单;②蛋白质的数目远大于基因的数目;③基因是相对静态的,生物体中的基因组在不同环境下是一样的,而蛋白质是动态的,随时间、空间的变化而变化。2-DE技术与蛋白质组学三大支撑技术:2-DE技术、质谱鉴定技术、图像分析技术2D-HPLC〔多维液相色谱〕色谱分别技术的优点,与2-DE的区分。定义:任何将混合物组分在两相中〔固定相和流淌相〕进展安排的分别技术都被称为色谱。原理:混合物溶解在同一溶剂中,当流淌相流经固定相时,混合物组分可以与溶剂以及固定相基质分子间发生作用。HPLC优点:〔包含区分〕① 速度快几个小时可完成全局部别,而2-DE分别一般需要1~2d。②自动化由于在溶液状态样品处理便利、快速,避开了2DE从胶上回收样品的繁复操作,分析过程易于与质谱联接。③多用途对各种蛋白质均适用,而2DE对分子量过大(>200kD)或过小(<10kD)蛋白质不易分别。 1-DE电泳技术的优缺点优点:① 免除了样品从1D胶向2D胶过渡时的繁复操作。② 与准确、灵敏、高区分的质谱鉴定技术相结合,可能进展成2-DE的替代方法之一。缺点:① 1-DE得到的分别度是相当有限的;② 在凝胶上的单一蛋白质条带实际上可能含有多种蛋白质;③ 在胶上蛋白酶切和多肽序列的直接测定方面还存在一些问题。Edman降解〔蛋白质测序方法〕与Sanger测序法的不同蛋白质N端测序 Edman降解法四个步骤:偶联、环化、裂解、转化Sanger试剂用于鉴定蛋白质和多肽的N-末端氨基酸残基。Sanger测序是用于DNA的测序。Edman降解法才是氨基酸序列的测定技术。但是它不能测超过40个残基的序列。X晶体衍射与核磁共振〔NMR〕X晶体衍射——气相集中法NMR——固相nmr,液相nmr第三章什么叫电泳?电泳的载体分哪两大类?凝胶作为载体的特点电泳技术就是由各种带电粒子在电场中迁移率不同而进展分别的一种技术。电泳的载体分凝胶电泳、有***电解质的载体?凝胶作为载体的特点:①孔径与蛋白质分子大小相近,而且具有制胶便利、易于显色、透亮等优点,是双向凝胶电泳的首选支持介质。② 凝胶通过分子筛的作用增加了蛋白质迁移时依靠于分子大小的分别力量。样品的制备包括哪几个过程细胞的裂开、裂解、蛋白质沉淀及杂质的去除细胞裂开裂解猎取蛋白质的方法,可以分为哪几类?①依据工具的不同,细胞裂开分为:机械法〔研磨法、组织捣碎法〕、物理法〔超声波处理法、反复冻融法、冷热交替法、压力杯法〕、化学与生物化学法〔有机溶剂处理法、酶解法、自溶法、渗透压冲击法〕;②依据裂开力度的不同,细胞裂开方法分为:温顺的方法、猛烈的方法样品制备过程中遵循的原则①要保证蛋白质的完全溶解②要避开蛋白质降解或丧失③要去除杂质的干扰④勿反复冻融以制备好的样品蛋白质沉淀的方法:盐析法、有机溶剂沉淀法〔三***醋酸〔TCA〕沉淀法、***沉淀法、TCA/***沉淀法、苯酚提取法〕、聚乙二醇沉淀法蛋白质裂解的buffer包括哪几个方面?① 变性剂:转变溶液离子强度和pH值,破坏蛋白质与蛋白质之间的相互作用;通过转变溶液中的氢键,破坏蛋白质的二级构造和三级构造,使蛋白质充分伸展。②外表活性剂:有助溶、变性和保护蛋白质的作用③复原剂:破坏蛋白质的二硫键,使蛋白质处于复原状态④载体***电解质:屏蔽蛋白质分子外表的疏水基团,增加蛋白质分子的溶解度;阻挡蛋白质样品和IPG胶条中固相化的***电解质发生相互作用⑤蛋白酶抑制剂:避开细胞裂开后细胞自身的蛋白质水解酶被释放出来并被激活,导致蛋白质组成分变得更加发杂2-DE中第一相要避开消灭哪些问题?重复性差、阴极漂移?3样品提取中有不同的杂质,不同杂质用什么去除?① 核酸沉淀法去除核酸:去除核酸常用方法是用核酸内切酶进展降解② 有机溶剂沉淀法去除杂质:多糖超速离心法脂类***沉淀,此外,蛋白质裂解液的变性剂也可削减蛋白质与脂类的结合次生代谢物或磷脂TCA/***沉淀③ 抑制剂去除多酚类物质④ 透析法去除盐离子和外源性带电小分子分级提取和亚细胞提取的策略、区分2-DE代表的含义蛋白质双向电泳技术:Two-dimensionelectrophoresis2-DE凝胶配备中有两个参数,这两个参数跟什么有关?〔书P61〕两个参数是T〔胶浓度〕和C〔N,N’-甲叉双丙烯酰***占两个单体总含量的百分比〕这两个参数和凝胶孔径大小有关。一般来说,T增加时凝胶孔径变小。2-DE一维和二维电泳的原理蛋白质双向电泳的第一向通常是等电聚焦 依据不同蛋白质分子所带电荷量的差异,以等电点聚焦技术进展分别〔蛋白质的等电点〕。该原理基于2个前提 蛋白质是***电解质;载体***电解质所形成的连续pH梯度二维电泳----依据蛋白质的相对分子质量大小不同,通过SDS凝胶电泳进展分别,相对分子量大的跑的快。从一相到二相中间经过什么过程 平衡过程;平衡液包括哪几个组分,作用是什么DTT和beta-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键保持欢送状态,有利于SDS和蛋白质的充分结合,从而在SDS-时电泳能顺当进展。平衡缓冲液包括6M尿素和30%甘油,会削减电内渗,有利于蛋白从第一向到其次向的转移。第一步平衡在平衡液中参加DTT,使变性的非烷基化的蛋白处于复原状态;其次步平衡步骤中参加碘乙酰***,使蛋白质巯烷基化,防止它们在电泳过程中重氧化,碘乙酰***并且能使残留的DTT烷基化。2-DE染色有哪几种方法?区分和优缺点①考马斯亮蓝染色:较准确地定量,能与质谱兼容;大多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,染色时间较长②银染:灵敏度较高;线性差,与质谱不兼容,试剂盒价格昂贵③负染:提高胶上蛋白质的回收率,可与质谱兼容;定量不够准确④荧光染色:对蛋白质无固定作用,与质谱兼容性好,灵敏度与银染相当,线性范围高于银染;价格昂贵,需要价格不菲的荧光扫描仪检测信号什么叫胶上酶解?酶解常用的酶有哪几种?为什么用有双识别位点的酶来切?胶上酶解:胶上的蛋白质不需要脱离胶体可直接把含有蛋白质样品的胶体放在溶液里进展酶解。酶解常用的酶:胰蛋白酶、Glu-C〔V8蛋白酶〕为什么用有双识别位点的酶来切2-DE方法中存在的一些问题?P60①低丰度蛋白质点的检测②极酸和极碱性蛋白质的分别③高分子质量蛋白质的分别在中参加SDS和BETA-巯基乙醇的作用SDS--一种很强的阴离子外表活性剂,可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的高级构造,强复原剂BETA-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。蛋白质组学的争论流程:细胞的裂开、裂解、蛋白质沉淀及杂质的去除第四章生物质谱仪组成三局部?每局部起什么作用质谱技术的原理:将样本分子离子化后,依据不同离子间质荷比〔m/z〕的差异来分别并检测离子的相对分子质量。①离子化源:将肽段转化为离子②质量分析器:依据离子的质量/电荷比〔m/z〕的不同来分别离子③离子检测器:检测质量分析器分别后的不同离子质谱性能用三个参数来描述〔关键性能指标〕:灵敏度、区分率、质量准确性质谱技术两种电离技术基质关心激光解吸电离质谱〔MALDI〕、电喷雾离子化质谱〔ESI〕MALDI是什么的简写:基质关心激光解吸电离〔Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization〕基质所起的作用:防止肽段聚拢;作为质子化试剂;吸取激光防止肽段裂开。 337nm脉冲光作用:让基质吸取光的脉冲能量防止离子化;让基质瞬间被脉冲,防止肽段讲解裂开。MALDI-TOF原理,几种不同的模式,为什么线型TOF带有误差原理:TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,依据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即测定离子的质荷比〔M/Z〕与离子的飞行时间成正比。模式:线性模式、反射器模式、延迟提取模式线性模式带有误差:用连续提取离子的线性模式,TOF仪器的质量区分率和测量准确度相对较低,测量误差在2%左右,这是由一样质荷比m/z的离子从进入TOF质量分析器时的速度不同造成的,即“非公正起始”。初速度不同,一样质荷比的离子到达的时间不同。MALDI-TOF-MS内部组成信息,源后衰变〔PSD〕原理是指在MALDI离子源中产生的离子〔母离子〕在飞行管道飞行过程中可能发生裂解,分解为中性碎片和子离子。TOF里的时间跟什么有关:飞行时间与离子m/z的平方根成正比ESI让肽段带上电的原理蛋白质溶液通过高压电针,弥散成带电液滴形成的细雾。四周的溶剂分子很快蒸发,带电的大分子被完整的吸入气相。在穿过电针时参加的质子是大分子带上了额外的电荷。ESI和MALDI两种技术的区分① MALDI只能让肽段带一个电荷,ESI让肽段带上多电荷层。② MALDI是样品跟基质混合,在结晶状态下发生电离,ESI是让样品在溶液中就可发生电离。③ 离子源方法不同,即让肽段带上电的方式不同。④ MALDI获得的是肽段质量指纹图谱的信息,ESI获得的是每个肽段中氨基酸的组成信息。5碰撞诱导电离〔CID〕获得肽段内部组成信息的原理MALDI-TOF-MS获得什么信息MALDI获得的是肽段质量指纹图谱的信息PSD、PSM两个信息有什么区分第五章常见的有哪些蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰:通过在1个或几个氨基酸残基上加上修饰基团或通过蛋白质水解剪切去基团而转变蛋白质的性质。主要形式:糖基化、二硫键的配对、***化、乙酰化、磷酸化、泛素化、羧基化、核糖激化蛋白质磷酸化一般发生在哪些氨基酸残基上?为什么发生在这些残基上?蛋白质磷酸化和去磷酸化分别在什么酶作用下?蛋白质磷酸化发生在:〔原核生物〕组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、〔真核生物〕丝氨酸、苏氨酸、络氨酸、〔自然存在〕精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸蛋白质磷酸化作用使蛋白质的功能延长转变蛋白质的疏水性激活或者抑制某一酶活性在细胞信号传导途径中,蛋白质磷酸化可以使蛋白质变为活性