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〔3〕图2SDS连续电泳〔1〕加样;〔2〕加电场,分子开头迁移;〔3〕电泳完毕〔1〕〔2〕〔3〕图3SDS不连续电泳〔分别胶为均一胶〕〔1〕加样;〔2〕加电场,样品浓缩在界面上;〔3〕电泳完毕〔1〕〔2〕〔3〕图5SDS不连续电泳〔分别胶为梯度胶〕〔1〕加样;〔2〕加电场,样品浓缩在界面上;〔3〕电泳完毕因此这种胶束在SDS聚丙烯酰***凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响,,。由此可见,SDS电泳不仅可以分别蛋白质,而且可以依据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子质量。见图2、3和4,这个规律对大局部蛋白质是适用的。只有少数蛋白质例外。SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中,特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有3个。溶液中SDS单体的浓度SDS在水溶液中是以单体和SDS多肽胶束SDS-。。在肯定温度和离子强度下。当SDS总浓度增加到某肯定值时,溶液中的单体浓度不再随SDS总浓度的增加而上升。PIttriver等、Flnlayson等和Reynolds等分别在1968—,大多数蛋白质与SDS结台的重量比为l:。:。这样就不能消退蛋白质分于原有的电荷差异,也就不能进展分子质量测定。为了保证蛋白质与SDS的充分结台,它们的重量比应为1:4或1:3。样品缓冲液的离子强度由于SDS结合到蛋白质分子上的量仅打算于平衡时SDS的单体浓度,不址总浓度,而只在低离子强度的溶液中,SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低,常为10~100mmol/L。二硫键是否完全被复原只有二硫键被彻底复原后,蛋白质分子才能被解聚。SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。样品缓冲液中β-巯基乙醇的浓度通蛋白质组学试验指导书 10常为4%~5%,二硫苏精醇的浓度通常为2%~3%。[试验仪器]电泳仪,垂直板电泳槽,移液器,玻璃板,塑料片等。[试剂配制]丙烯酰******+,N-甲叉烈丙烯酰***,先用35ml双蒸水溶解搅拌,直到溶液变成透亮,。用棕色瓶可在4℃保存一个月。两种单体和溶液都是中枢神经毒物,要留神操作。浓缩胶缓冲液贮液(-HCL,),再用双蒸水加至50m1。4℃保存。分别胶缓冲液贮液(-HCL,),用4mol/L盐酸调整pH至s8,再用双蒸水加至50ml。4℃保存。10%SDS25gSDS,用双蒸水溶解至250ml室温保存。10%过硫酸铵:。使用前颖配制。电极缓冲液:,1gSDS,,:40%甲醇和5%乙酸,%考马思亮蓝R250(8)脱色液:20%甲醇,10%醋酸样品溶解液:100mgSDS、-巯基乙醇、1ml甘油、2mg溴酚蓝、-HCl,蒸馏水定容至10ml。[试验步骤]1、洗玻璃板,放烘箱烘干〔70℃左右〕。2、电泳槽的安装。取出烘好的玻璃板放上边条用防水胶带粘好3、配制分别胶,灌胶到距短玻璃上边缘2cm处,覆上一层水层。静止聚合约40min左右4、配制浓缩胶,灌胶,插上梳子。5、-,沸水浴保温2-3分钟,取出冷至室温待用。6、点样。用微量进样器吸取标准蛋白质样品与待测样品分别注入样品槽内。7、电泳。加样完毕,两槽注入电极缓冲液,接通电源〔上负下正〕,电流为15mA,当指示剂进入分别胶加大电流到30MA,电压在80~100V之间,约3H后,指示剂到达距前沿1~2CM处可终止电泳。8、固定和染色。胶取出后,在水中浸泡5min,然后放在固定液过夜。9、脱色。,,至少换3次,待蓝色根本脱蛋白质组学试验指导书 10掉,再放在脱色液中浸泡至蛋白质谱带清楚为止。%分别胶:30%Acr/Bis 25ml10%SDS 1mlddwater 50μl10%AP 500μlTotal 100ml5%浓缩胶:30%Acr/Bis 3mlTris-Hcl() 45μl10%AP 150μlTotal 18ml[试验结果]通常以相对迁移率〔m〕来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下:r用直尺分别量出样品区带中心与凝胶顶端的距离,按下式计算:相对迁移率〔m〕=样品迁移距离〔cm〕/染料迁移距离〔cm〕。r以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移作图,得到标准曲线。依据待测样品的相对迁移率,从标准曲线上查出其相对分子质量。蛋白质组学试验指导书 10试验二植物叶片总蛋白的提取[试验目的]把握组织材料总蛋白质的提取技术[试验原理]依据植物组织的特点,由于植物组织含有坚韧的细胞壁和简单的细胞外基质等。所以在样品制备时要承受更猛烈的裂开方法才能裂开细胞获得样品。对于植物材料来说,标准的蛋白质提取方案用TCA/***溶藏中沉淀蛋白质。然后用含去污剂的裂解液来溶解沉淀这一种方法的优点是:抑制在单位质量的植物组织中蛋白质提取量低的问题;去除了植物次级代谢产物带来的影响;。其缺点在于由于不充分地沉淀和溶解而选择性地丧失某些蛋白质。。[试验仪器]研钵,低温高速离心机,高速离心管,移液器,低温冰箱,烘干箱,真空抽气泵等。[试剂配制]10%TCA***:%β-me预冷***:%β-me***PVP[试验步骤]TCA/***法粗提法:,用液氮研磨成粉参加15ml预冷10%TCA***〔%β-me〕于-20℃冰箱中过夜 4℃12023rpm离心15分钟,弃上清,参加15ml预冷***〔%β-me〕于-20℃冰箱中过夜/2h4℃12023rpm离心15分钟,弃上清,参加15ml预冷***,重悬,于-20℃冰箱中过夜/2h重复步骤44℃12023rpm离心15分钟,弃上清,抽真空制成干粉,-70℃保存。蛋白质组学试验指导书 10试验三蛋白浓度测定-Brandford法[试验目的]把握“Brandford法”测定蛋白质含量的方法步骤[试验原理]1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法〔Bradford法〕,是依据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸取峰的位置〔max〕,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经争论认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸〔特别是精氨酸〕和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。[试验仪器]台式离心机,紫外分光光度计,移液器,。[试验步骤及试剂配制]1蛋白干粉裂解称取20mg蛋白干粉按1:10-15参加裂解液300ul,振荡混匀,37℃水浴保温70min,期间摇动数次。Lysis裂解液:9MUrea,40mMTris,4%CHAPs,2%Ampholine〔-10〕,1%DTT,分装-20℃保存,不行反复冻融。12023rpm离心15min,取上清,分装-70℃保存,待用。标曲制作标准溶液〔1mg/ml〕:取10mg牛血清白蛋白溶于10ml蒸馏水;工作液:取10mg考马斯亮蓝G-250溶于5ml95%乙醇,再参加10ml85%磷酸,最终用蒸馏水定容到100ml,备用〔一周内有效〕;:。编号0123456789标准溶液〔ul〕〔ul〕10101010101010101010蒸馏水〔ul〕9080706050403020100工作液〔ml〕5555555555混匀5min后,595nm比色终浓度(ug/ul)0123456789蛋白质组学试验指导书 10样品测定取10ul样品裂解上清液,,最终参加5ml工作液,混匀同上比色〔1小时内测定有效〕。[试验结果]测得样品的吸光度代入标准曲线方程可得。蛋白质组学试验指导书 10试验四等电聚焦——IEF[试验目的]把握第一相等电聚焦技术[试验原理]双向凝胶电泳的分别系统是应用蛋白质分子两个独立的不同物理参数对蛋白质分子进展分别。第一向是依据不同蛋白质分子所带电荷量的差异,以等电点聚焦技术进展分别。其次向是依据蛋白质分子量大小的不同,通过SDS凝胶电泳进展分别。在第一向等电点聚焦电泳中。由于蛋白质分子在不同的pH环境中带不同数量的正电荷或负电荷,当在某一pH值时,蛋白质的净电荷为零,此pH值即为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点仅打算于它的氨基酸组成,因此不同蛋白质都有其各自的等电点。细胞中pI值范围格外宽广,因此可以利用它来进展蛋白质的分别和分析。传统的O’Farrell载体***电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中参加载体***电解质,通以直流电后在两极之间形成稳定的、连续和线性的pH梯度。当带电的蛋白质分子进入此系统时便移动聚焦至相当于其等电点的位置,因此在双向电泳中的第一向是依照等电点的不同将蛋白质进展分别。但这种利用载体***电解质形成pH梯度的方法存在操作烦琐、pH梯度不稳定及重复性等问题。。这是利用合成一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰***衍生物(acralamidobuffers).它们与丙烯酰***和亚***双丙烯酰******的共价聚合,从而形成稳定的不随环境电场等条件变化的pH梯度。由Pharmacia公司生产的IPG介质商品名为Immobiline,构造式如下Immobiline分子的一端是双键,因此在聚合的过程中可通过共价结合嵌合至聚丙烯酰***介质中。在分子的另外一端是缓冲基团R,R是弱酸或弱碱的缓冲基团,在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。固相pH梯度凝胶的制作可以由两组一系列不同pKa值的Immoobiline与丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***按不同比倒经梯度混合,Immobiline共价结合到丙烯酰***凝胶中,从而形成固相pH梯度凝胶。固相pH梯度与载体***电解质pH梯度区分在于前者的介质不是***分子。它是在凝胶聚合时便形成pH梯度,而后者是***分子,需在电场中当***分子迁移至各自的等电电时才形成pH梯度。由于固相pH介质与聚丙烯酰***共价结合,因此形成的pH梯度不受脱水、重水化和电场因素的影响,所形成的PH梯度格外稳定。固相pH梯度凝胶上样量大,平衡时蛋白质不易被洗脱,易进入其次向凝胶。蛋白质组学试验指导书 10图1固相pH凝胶构造示意图双向电泳的其次向是SDS凝胶电泳,SDS是一各阴离子外表活性剂,它能破坏蛋白质分子间的非共价结合,使蛋白质变性而转变原有的构象。特别是在强复原剂B-巯基乙醇存在的状况下,由于蛋白质分子的二硫键已被复原,这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。这种复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子意有的电荷,因而消退了不同蛋白质分子间的电荷差异,且流体力学和光学性质说明蛋白质与SDS所形成的复合物为长椭圆棒形,蛋白质分子在SDS系统中的共迁移率不再受电荷和分子外形等因素的影响,其迁移率主要打算于蛋白质分子量的大小。当第一向IEF电泳完毕后,需向其次向SDS电泳转移。在这个过程中,不管是传统的IEF电泳或固相pH梯度IEF电泳,在转移前都需要经过其次向SDS电泳分别系统溶液进展平衡,平衡的目的是通过平衡液中的DTT或B-巯基乙醇使蛋白质分于中的二硫键保持复原状态,有利于SDS与蛋白质的充分结合。另外,在平衡过程中使等电聚焦凝胶中的***载体电解质或固相pH梯度IEF中永化液成分及高浓度的脲集中出凝胶,。通常平衡需经过两步,其次步承受碘乙酰***,否则自由的DTT在二向胶中迁移会产生点条纹假象。另外,假设用TBP取代DTT就可以只进展一步平衡,由于TBP不带电荷,在SDS-过程中不迁移。[试验仪器]电源,IPG电泳仪,移液器,水浴锅,镊子,玻璃管,医用针头等。[试剂配制]储存液配制第一向储存液和缓冲液裂解缓冲液(lysisbuffer):9MUrea,40mMTris,4%CHAPs,2%Ampholine〔-10〕,1%DTT,分装-80℃保存,不行反复冻融。掩盖缓冲液(overlaybuffer):8mol/LUrea,1%Ampholyte(pH3~10),%B-巯基乙醇,-80℃保存。蛋白质组学试验指导书 10