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二)寇氏(Korbor):除另有要求外,一般应在预试中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以下死亡的剂量,分别作为正式试验的最高与最低量。:除另有要求外,一般设510个剂量组,每组610只动物为宜。:将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数,然后将最高、最低剂量的对数差,按所需耍的组数,分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。(1)列试验数据及其计算表包括各组剂量(mg/kgBWg/kgBw,剂量对数(X),动物数n,动物死亡数r动物死亡百分比(P,以小数表示),以及统计公式中要求的其它计算数据项目。,可分别选用下列三个公式中的一个,求出logLD50,再查其自然数,即LD50mg/kgBWg/kgBw)。(2)按本试验设计得出的任何结果,均可用式(1式中:Xi与Xi1及Pi1与Pi——分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。(3)按本试验设计且各组间剂量对数等距时,可用式(2:式中:XK——最高剂量对数,其它同式(l)。(4)、最低剂量组动物死亡百分比分别为100〔全死)和0(全不死时),则可用便于计算的式(3)。式中:∑P一一各组动物死亡百分比之和,其它同式(2。(5)标准误与95%可信限①logLD50的标准误(S:②295%可信限(X:四、操作步骤(一)受试物的处理受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中。一般采用水或食用植物油作溶剂,可以考虑用羧***纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液;不能配制成混悬液时,可配制成其它形式(如糊状物等)。必要时可采用二***亚砜。但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。(二)受试:..物的给予1途径:经口。2试验前空腹:动物应隔夜空腹(一般禁食I6h左右,不限制饮水)。3容量:各剂量组的灌胃容量相同(mL/kgBW,小鼠常用容量为20mL/kgBW;大鼠常用容量10mL/kgBW。4方式:一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予(每次间隔46h24h内不超过3次,尽可能达到最大剂量,合并作为一次剂量计算)。五、计算及评价(一)LD50计算:根据两周内实验动物的死亡数用寇氏法或概率单位法或直线回归法计算受试物小鼠经口染毒LD50及95%可信限。(二)评价:根据动物的中毒症状及死亡时间,推测受试物的可能作用部位及经口毒性特点。并参照化合物急性毒性分级标准对其毒性作出估价。实验剂量选择及分组本实验在标准LD50175mg/kg上下取值,实验取了464,215,100,,参加实验的同学分成四组,每组选择一个剂量对5只小鼠进行实验。(2)实验动物的性别鉴定、编号和称重每组对本实验组的5只小鼠分别进行性别鉴定、编号和称重。;编号采用染色法,常用苦味酸饱和液为染料。一般从头部开始编号,头部为1号,按顺时针方向向右前肢为2号,右肋为3号,右后肢为4号,尾部为5号,左后肢为6号,左肋为7号,左前肢为8号,背部为9号,不染色为10号。(3)亚***钠溶液的配制根据每只小鼠的重量和每组的实验剂量计算出每只小鼠的染毒量,,进行灌胃。(4)灌胃染毒将灌胃针与注射器连接后,吸取一定量受试物亚***钠溶液。左手抓住小鼠头和背部皮肤,使鼠呈直力状,右手持注射器,沿小鼠咽喉壁左边经食道将灌?刚氩迦胛改冢ㄉ疃任?4cm),注入受试物亚***钠溶液。(5)观察灌胃后24h的小鼠死亡情况,记录后,根据霍氏LD50表查得亚***盐值。3结果与讨论小鼠灌胃后24h,观察每组的死亡情况如下表。实验组采用小鼠数量灌胃量(mg/kg),由死亡数分别为(a,b,c,d),查得亚***盐值,如和标准的亚***盐值175mg/kg非常接近,就验证了本次实验方法和操作的较准确性。一、原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时,仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后,单独形成一个或几个规则的次核,被包含在细胞的胞质内而形成,由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外,,代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微核稍大。二、,生物显微镜,载玻片等。℃恒温水浴保温lh进行灭活。通常储存于4℃冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。,加入375mL甲醇(分析纯)研磨,待完全溶解后,再加入125mL甘油。置37℃恒温箱保温48h振摇数次。过滤两周后用。4Glemsa应用液取1份Glemsa染液与9份磷酸盐缓冲液混合而成。临用时配制。((分析纯)。全部试剂除注明外,均为分析纯,、实验动物小鼠是微核试验的常规动物,也可选用大鼠。通常用712周龄,体重2530g的小鼠或体重150200g的大鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。动物购买后适应环境至少3天。四、剂量及分组受试物应设三个剂量组,最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量,一般可取1/2LD50,低剂量组应不表现出毒性,分别取1/4和1/8LD50作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃容量)动物:..无死亡而求不出LD50时,高剂量组则以以下顺序(1)10g/kgBw;2)人的可能摄入量的100倍;或3)一次最大灌胃剂量进行设计,再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照物可用环磷酰***40mg/kgBW经口或腹腔注射(首选经口)给予。五、,可用食用油、医用淀粉、羧***纤维素等配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制,除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。。根据细胞周期和不同物质的作用特点,可先做预试,确定取材时间。常用30给受试物法。即两次给受试物间隔24h,第二次给受试物后6h,颈椎脱臼处死动物。,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后放入甲醇中固定510min。当日固定后保存。将同定好的涂片放入Giemsa应用液中,染色1015min。、晾干。写好标签,阴凉干燥处保存。、分散均匀,着色适当的区域,在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。本法系观察嗜多染红细胞的微核,用Giemsa染色法,嗜多染红细胞呈灰蓝色,成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐,嗜***与核质一致,呈紫红色或蓝紫色,直径通常为红细胞的1/201/5。用双盲法阅片。每只动物计数1000个嗜多染红细胞,观察含有微核的嗜多染红细胞数,微核率以千分率表示。观察嗜多染红细胞与成熟红细胞〔PCE/RBC,可作为细胞毒性指标之一。%。六、数据处理一般采用卡方检验、泊松分布、或双侧t检验等统计方法进行数据处理,并按动物性别分别统计。七、结果评价试验组与对照组相比,试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时,即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性,但无剂量反应关系时,则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。一般阴性对照组的微核率<5‰,供参考。但应有本试验室所用实验动物的自发微核率作参考。学****动物骨髓细胞染色体标本制作了解动物体内染毒及染色体畸变类型。染色体畸变的产生与微核的形成原理相同,观察终点不同,染色体畸变只能在细胞分裂的中期相进行观察和分析。为收集足够的中期相细胞,在收获细胞前,用秋水仙素碱或乙酰***秋水仙碱处理,以阻断微管蛋白的聚合,抑制细胞分裂时纺锤体的形成,使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。细胞通过低渗,使染色体均匀散开,然后固定、染色,可在油镜下观察。⒈器材小剪刀、镊子、10ml离心管、滴管、载玻片、离心机、.