文档介绍：西北农林科技大学
磁小体膜蛋白基因的克隆及蛋白纯化模拟
生物技术虚拟实验
宋捷生物技术122 学号:2012014069
2015/7/4
设计
基因及质粒
在NCBI上检索想要的基因名,限定物种,下载它的核酸序列fasta gb格式,以及蛋白序列
物种名:Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales;
Rhodospirillaceae; ospirillum.
菌株:ospirillum gryphiswaldense MSR-1
开放阅读框的寻找
使用ORFfinder 寻找该核酸序列的ORF区域,由于该序列已经有完整的已经探索过的CDS区域,故使用CDS区作为之后的目的基因片段
载体和基因的检查
打开vector NTI 建立自己的项目文件
在vector NTI中找到想用的质粒pET-16b,保存。
录入自己的目的基因序列,gb格式
酶切位点的检查
检查常用的酶切位点
在目的片段mms16中有Pst 1 , Nco 1两个位点
在质粒的酶切位点寻找中剔除这两个位点的识别
结果如图
目的在这个区域的Nde 1 和 BamH 1中进行双酶切插入目的片段
引物设计
该CDS区位于序列的605-1042bp,
上游
ACGG GGCGGTTCGTCT
A是调节退火温度设计的,CGG是保护碱基,是Nde 1的酶切位点,由于酶切后该酶切位点依旧存留起始密码子,故删掉了序列本身的起始密码子
下游
TAGG GCG
CCTAGG是BamH 1的酶切位点
退火温度差异很小
连接入质粒
因为该启动子是逆时针方向,所以将CDS序列反向互补
然后复制粘贴到质粒的两个酶切位点之间
电泳
将该添加过目的基因的质粒添加到虚拟电泳程序中
使用Maker
使用BamH1 和Nde1两种酶,没有酶加入,和maker
可以看到在双酶切的两条带,上边是切开的质粒(约6000bp),下部分是目的基因片段(约400bp),对照Maker最大8000最小370. 不酶切的质粒略大于酶切的大片段条带,合理。
蛋白质性质预测
(16kd)。
一个较大的疏水区