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电位梯度的不连续性使得蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带,成为浓缩效应。自己查的凝胶由两种不同的凝胶层组成,上层为浓缩胶,下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶,缓冲液pH67,分离胶为小孔胶,,这样便形成凝胶孔径和缓冲液ph值的不连续性。浓缩胶中HCl全部解离为Cl-,称为快离子,极少部分甘氨酸()解离为Gly-,称为慢离子。有效泳动率依次为Cl->蛋白质>Gly-。电泳开始后,快离子泳动到最前面,快慢离子之间形成一个离子浓度低的区域,即低电导区域,而电导与电压梯度成反比,因此低电导区有较高的电压梯度,驱使慢离子加速泳动。当快慢离子移动速率相等时,就建立一个不断向阳极移动的界面,蛋白质的泳动速度恰好介于快慢离子之间,因而被挤压在快慢离子之间形成一条窄带。这种浓缩作用可使蛋白质浓缩数百倍。另一方面,浓缩胶为大孔径凝胶,分离胶为小孔径凝胶,待分离蛋白质在大孔凝胶中受到阻力小,移动速度快,泳动到小孔凝胶处时,阻力突然加大,速度变慢,这样就在两种凝胶的交界处使待分离样品的区带变窄,浓度升高。-PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的:..对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。21、乙醇沉淀提取酶需要注意哪些事项?(1)必须缓慢加入(2)边加边搅拌(3)避免产生泡沫,使蛋白质的溶解度呈一个光滑的曲线(4)提取液和乙醇在混合时要采取冰浴,混合过程不少于35min。22、影响酶活力的因素有哪些?pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、,目的又是什么柱平衡指在柱的使用前用PH与样品相同的缓冲液对柱子进行冲洗。目的是使柱子上的基团都带有离子交换剂中的阳离子,并在柱内营造一个相同的外在环境,减少样品本身特性因素外其他因素的影响:PH、-PAGE均具有分子筛的作用,说明它们有何不同?为什么?过滤层析:当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长、阻力大、流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短、阻力小、流速快,先于小分子流出层析柱;分子大小介于两者之间的则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差:..蛋白质跑得慢,分子量小的蛋白质的条带在前面。?穿透峰中含有哪些物质?用来洗掉缓冲液中未与交换剂结合的蛋白质,使复杂的组份分离完全。穿透峰中包括大量未结合的游离蛋白如阳离子的杂蛋白、不带电荷的杂蛋白、带阴离子的杂蛋白。26、什么叫对照实验?如何做对照实验?对照组是在需要进行对比的科学实验中,起辅助、对比作用,以突出并有力支持从实验组所能得出结论的单组或多组实验。在比较性实验研究中,将实验对象分为二个或数个独立的组,其中一组施加实验因素,而另一组不施加或施加其他因素。前者称为实验组,后者即为对照组。对照又分为空白对照、自身对照、条件对照、相互对照等类型。对照组要尽可能消除无关变量。如何做:设置对照组有4种方法:(1)空白对照(2)条件对照(3)自身对照(4)相互对照①所有用生物材料要相同。即所用生物材料的数量、质量、长度、体积、来源和生理状况等方面特点要尽量相同或至少大致相同。②所用实验器具要相同。即试管、烧杯、水槽、广口瓶等器具的大小型号要完全一样。③所用实验试剂要相同。即试剂的成分、浓度、体积要相同。尤其要注意体积上等量的问题。④所用处理方法要相同。如:保温或冷却:光照或黑暗;搅拌或振荡都要一致。有时尽管某种处理对对照实验来说,看起来似乎是毫无意义的,但最好还是要作同样的处理。27、用离子交换层析分离蛋白质,流动相的pH如何选择?对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱,阴离子交换剂一般是pH值从高到低。,在pH为7时呈负电与结合剂结合。,,使蔗糖酶带的阴离子逐渐减小,结合力减弱,即可将结合的蔗糖酶被洗脱下来:..、离心机使用需要注意哪些?1、离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上,不允许倾斜;2、通常离心机都会有登记表,请在使用前确实登记使用者、转头、转速、时间;3、离心管一定要用天平平衡重量(重量平衡),盖上离心管盖子并旋紧;4、把平衡好的离心管对称地放入离心陀中(位置平衡),盖上离心陀的盖子,注意有无旋紧;5、完成离心时,要等待离心机自动停止,不允许用手或其他物件迫使离心机停转,待转头完全静止后,才能打开舱门,请尽快取出离心管,先观察离心管是否完全,以及沉淀的位置,尽速把上清倒出,小心不要把沉淀弄混浊。?为什么要梯度洗脱?梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中,按一定程度不断改变流动相的浓度配比,称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时,降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来,用含阴离子(如Cl-)的溶液洗柱,含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来,增加Cl-浓度,含电荷多的蛋白质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。梯度洗脱的优点:;;,很少拖尾;。但有时引起基线漂移。,常用的有哪几种终止酶反应的方法?(1)温度调节:酶促反应一般都在一定的温度范围内有效,可以突然降低温度或者升高温度,使酶失去活性。(2)pH调节:酶在一定的pH内具有活性,超出一定范围后降低或失去活性。:..3)加酶的抑制剂(如底物类似物,某些金属离子等),使得酶失去活力。(4)大部分酶是蛋白质,可3加入有机溶剂使其变性。31、使用分光光度计的比色皿有哪几种?各在什么场合使用?按使用的波长范围可分为三大系列,即可见光系列(称玻璃比色皿),紫外可见光系列(称石英比色皿),红外光系列(称红外比色皿)测试在紫外区有吸收的样品时用石英比色皿,测试只在可见光区有吸收的样品时使用玻璃比色皿,测试在红外区有吸收的样品时用红外比色皿32、为什么要做对照实验?凯氏定氮实验中用到的硫酸铜、硫酸钾各起什么作用?设置对照组的目的在于①消除无关变量对实验结果的影响,增强实验结果的可信度。②检验对比试验的效果。实验组和对照组之间仅有一个变量变化,结果不一样的地方一般认为就是由那个变量引起的。没有对照组,实验组的实验结果将会无法确定。33、酶反应需要控制哪些实验条件?如何控制?温度:对酶的作用具有双重影响,在较低的温度范围内,酶反应速度随温度升高而增大,但是超过一定温度后,反应速度反而下降。酶促反应的温度要尽量控制在恒定的最适温度下进行,温度波动要控制在±1℃。该实验要将反应温度控制在35℃进行。控制温度恒定的方法最常见的就是水浴加热保温,将两种或多种反应体系中的反应液分别在相同温度的水浴中进行预加热,然后在该温度下混合反应,准确测定反应时间后取出,测定酶活。pH:在最适pH时,酶的活性最强,高于或低于最适pH,酶的活性都降低。。控制反应的pH可以①通过加入一定量的缓冲液(例如PBS缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液)缓冲液要有足够的缓冲容量,缓冲液的pKa与最适pH越接近,缓冲容量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反应,对缓冲容量的要求更高。②通过pH计在显示器上实时反映体系中的pH值,用滴管:..HCl或NaOH使反应体系的pH达到最适pH。直接用缓冲液反应时间:酶活力测定时要控制好反应时间,并且各管的酶反应时间一定要一致。该反应规定蔗糖酶的活力单位是在3min内转化底物的酶量,所以应控制反应时间为准确的3min。将反应体系各溶液配制好或准备好后,分别在水浴中预热到最适温度,将最后一种反应物添加进去立刻摇匀后立刻用秒表等计时工具进行精确的计时。一定反应时间后,立刻加入终止反应的物质使反应停止,即可测定这段时间内的酶活力。34、比色法测定时,OD值超过标准曲线线性范围时,为什么不能直接稀释已经显色的样品,而必须改变取样量重新显色,再测OD值?因为参加显色反应的物质浓度也影响了显色反应后OD值的线性。使得OD值超出线性范围的不是OD值本身过高,而是加的反应物浓度太高或太低,不能正常显色(虽然颜色可能是对的),超出了显色反应的线性。测出的OD值数据就是不准的,需要重新取样使OD值在线性范围内。35、丙烯酰胺聚合原理?凝胶孔径如何调节?聚丙烯酰胺聚合原理:①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(以后简称单体)在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物,是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。②聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛作用,从而增高了它的分辨能力。③聚合物分子中含有很多酰胺基,所以凝胶具有良好的亲水性。能在水中溶胀但不溶解。:..聚合时,根据分离的需要,可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔度大小不同的凝胶。一般情况下,浓缩胶中丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺的浓度在3%-5%,垂直槽跑蛋白,小于3%的,浓缩胶就非常脆弱了,大于5%的,胶就相对脆硬了,最适合的浓度需要经过自己的实验进行尝试。、、SDS在凝胶电泳中的作用是什么?为什么分离胶灌胶以后要在上面覆盖一层水?SDS:变性剂,用来变性蛋白和破坏蛋白二、三级结构。过硫酸铵(AP)是引发剂:这个聚合反应是自由基聚合,需要有引发剂产生自由基将反应引发。TEMED(加速剂):可以催化过硫酸铵产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基,而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。加水:①隔绝空气使催化反应快速进行,进而形成凝胶②使分离胶上沿平直。并且加水后,保持分离胶表面的平整性,使浓缩胶和分离胶都处于同一水平面上。