文档介绍：ELISA试剂的选用和质检
卫生部临床检验中心
王露楠
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影响试剂盒质量的因素
试剂盒的选用
试剂盒的质检方法
目前试剂盒存在的问题
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影响试剂盒质量的因素
(1)固相材料商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板,其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异。
(2)抗原--自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。
纯度:纯度不高可致试剂盒的特异性不强。
立体结构:合成抗原一般都是多肽抗原,缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇,用于相应的抗HCV和抗HIV抗体的检测有可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。
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影响试剂盒质量的因素
(3)抗体
多克隆抗体(多抗):制备简单,含针对抗原的多种决定簇,但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗,且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。
单克隆抗体(单抗):可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体,缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA测定方法时,如包被和指示抗体使用同一单抗,则由于结合位点的缺乏,很容易造成假阴性结果,尤其是在使用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此,在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时,包被和指示抗体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗,包被抗体可为混合单抗,从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原。
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影响试剂盒质量的因素
(4)酶结合物 ELISA试剂盒的核心部分,通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的。
辣根过氧化物酶(HRP):易于提取,价格相对低廉;性质稳定,耐热及有机溶剂的作用,与抗原或抗体偶联后,活性很少受损失。
碱性磷酸酶(ALP):碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用
F半乳糖甘酶
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影响试剂盒质量的因素
(5)色原底物:HRP最常用的色原底物有邻苯二***(OPD)和四***联苯***(TMB) 。
邻苯二***(OPD):OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一,,最大吸收波长为492nm,显色加深,因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。
四***联苯***(TMB):氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液态试剂,即一定浓度双氧水溶液和TMB。它们在溶液中相对不稳定,因此在使用ELISA试剂盒时,如底物A·或/和B出现颜色,或各取一滴混合后显色,说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染,必须废弃。·
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影响试剂盒质量的因素
双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
洗板
待测
抗体
底物
温育
显色
酶标
抗原
E
E
洗板
Y
Y
Y
Y
Y
Y
固相
抗原
E
Y
Y
Y
E
E
E
Y
Y
Y
E
E
E
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影响试剂盒质量的因素
间接法测抗体(抗HCV、Tp)
洗板
待测
抗体
底物
温育
显色
E
Y
酶标
抗体
E
Y
E
Y
洗板
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
E
Y
E
Y
E
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Y
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Y
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E
Y
E
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固相
抗原
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影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-两步法
固相
抗体
温育
待测
抗原
底物
温育
显色
Y
Y
Y
E
Y
酶标
抗体
E
Y
E
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Y
Y
Y
Y
Y
Y
E
Y
E
Y
E
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Y
Y
E
Y
E
Y
E
Y
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影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-一步法
待测
抗原
底物
温育
显色
固相
抗体
Y
Y
Y
E
Y
酶标
抗体
E
Y
E
Y
Y
Y
Y
E
Y
E
Y
E
Y
洗板
Y
Y
Y
E
Y
E
Y
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