文档介绍:CD158a表达调节胃癌患者CTL细胞功能的体外研究
作者:刘振华, 陈晓耕, 林孟波, 黄毅
【摘要】目的研究CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。方法利用免疫磁珠法分选培养表达与不表达CD158a的两型细胞,MTT法测定其体外杀伤胃癌MNK45细胞的活性,Elispot试验检测其分泌细胞因子的变化,RTPCR方法检测其mRNA的表达差异及CD158a受体激发后(Trigerring)的细胞毒T细胞凋亡情况。结果 CD158a+ CTL几乎不杀伤人胃癌MNK45细胞,但阻断相应CD158a分子或靶细胞MHC1分子后,杀伤活性得到一定程度恢复。CD158a- CTL以分泌γIFN为主,参与Th1反应,而CD158a+ CTL主要分泌IL4,可能介导Th2反应。3例胃癌患者的CD158a+ CTL细胞均可扩增出300 cDNA特征性条带。CD158a分子激发后,CD158a+ CTL凋亡细胞具有显著的形态学特征,DNA电泳有典型的“ladder”梯型条带。结论 CD158a表达抑制胃癌CTL体外杀瘤活性,影响其细胞因子的分泌,并在激发后诱导CTL细胞凋亡。
【关键词】胃肿瘤 T淋巴细胞细胞毒性杀伤细胞天然受休细胞表面
近年来,杀伤细胞抑制受体(killer inhibition receptor, KIR)的发现丰富了学者对肿瘤免疫调节的认识。KIR主要表达于人自然杀伤(NK)细胞和某些T淋巴细胞,,相对应人白细胞抗原(HLA)配基为HLA
CW 2、4、5、6血清型。通过与主要组织相容性复合物抗原Ⅰ类分子(MHC Ⅰ)结合,传递负性调控信号,在机体抗肿瘤免疫及移植排斥中发挥重要调节作用。Gati等研究表明,来源于肾癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒性T细胞(CTL)表面KIR分子可下调CTL杀瘤效能,认为KIR表达是CD8+ CTL免疫无能的主要机制,揭示CD158a分子有助于免疫逃逸[1]。本研究旨在揭示CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。
1 材料和方法
胃癌患者T细胞表达CD158a测定参照文献[2]的方法,分离3例患者T细胞及诱导CTL细胞,采用直接免疫荧光标记技术,分别标记抗体FITCDX27(antiCD158a,IgG1,美国Immunotech公司),设同型、同标记鼠抗人单抗作空白对照。检测3例患者的分离新鲜T细胞及其CTL细胞表达CD158a的情况。
CD158a+ CTL与CD158a- CTL的分选培养利用有限稀释克隆技术,当阳性孔克隆细胞生长到一定数量级(每孔105时,利用荧光标记单抗结合流式细胞仪检测其表型,标记后作相应培养、扩增,AIMV培养基含rIL2 800 IU/mL(北京瑞得一合通公司)。每3~5 d换液1次,每周添加1次抗原及维持量的rIL
2 (400 IU/mL)以维持CTL细胞活性。免疫磁珠法分选两型细胞,具体操作参见说明书(美国Stem cells公司)。
CD158a+ CTL与CD158a-CTL细胞的体外杀瘤活性人胃癌MNK45细胞由苏州大学医学院张学光教授惠赠。体外杀瘤活性检测取效∶靶比(10∶1),MTT法测定[3],λ=490 nm,计