文档介绍：选修3《现代生物科技专题》知识点总结
专题1   基因工程
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。
(一)基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同:
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
DNA连接酶
DNA聚合酶
不同点
连接的DNA
双链
单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DN***段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DN***段上
相同点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
: 编码蛋白质的结构基因。
,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
(1)PCR的含义:是一项在生物体外复制特定DN***段的核酸合成技术。
(2)目的:获取大量的目的基因
(3)原理:DNA双链复制
(4)过程:第一步:加热至90~95℃DNA解链为单链;
第二步:冷却到55~60℃,引物与两条单链DNA结合;
第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
(5)特点:指数(2n)形式扩增
第二步:基因表达载体的构建(核心)
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞_
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
:
将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最常用的原核细胞是大肠杆菌,其转化方法是:先用 Ca2+ 处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。
,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步:目的基因的检测和表达
,方法是采用DNA分子杂交(DNA-DNA)技术。
,方法是采用分子杂交(DNA-RNA)技术。
,方法是采用抗原—抗体杂交技术。
。如生物抗虫或抗病的鉴定等。
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