PCR基因扩增.ppt

文档介绍：PCR基因扩增
实验四
一、实验目的
1)学****掌握PCR反应原理
2)掌握PCR技术的操作过程
3)通过PCR获得银杏黄***代谢过程中的一个关键酶基因——CHS基因(查尔***异构酶基因)
二、实验原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
三、实验试剂、材料、仪器
试剂:Taq DNA聚合酶,PCR缓冲液(含MgCl2),dNTP()混合物,引物() ;琼脂糖,50×TAE 缓冲液,无菌双蒸水等
材料:银杏DNA
仪器:微量移液器,吸头, PCR薄壁管,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,微波炉等
四、操作步骤
1)取一个干净的PCR薄壁管
2)往PCR管里面加入各种试剂:
Primer1 1μl
Primer2 1μl
DNA模板 3μl
10*buffer 3μl
dNTP 2μl
Taq酶
无菌ddH2O
30μl
3)设定好PCR反应程序如下:
95℃ 4 min
95℃ 50s
57℃ 35 cycles
72℃ 2min
72℃ 10 min
End
4)开始PCR
5)1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果
五、注意事项
1)PCR非常灵敏, 注意移液器的规范使用,保证各种反应试剂吸取的精确性。
2)所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染;吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂。
3) PCR的所用试剂应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
六、作业
1)将你PCR实验结果的电泳图片附在实验报告上,并根据图片分析你扩增的结果
2)思考:有哪些因素会影响PCR的质量?
DNA的结构(1)
三磷酸核糖核苷NTP
三磷酸脱氧核糖核苷dNTP
三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP
补充:PCR 原理
DNA的结构(2)
A腺嘌呤
G鸟嘌呤
C胞嘧啶
U尿嘧啶
T胸腺嘧啶
五种碱基
A-T C-G
DNA的结构(3)
氢键维持了DNA的双螺旋结构
DNA的复制(1)
3’-OH进攻5’- Pi
DNA聚合酶催化
DNA的延伸方向:5’->3’