文档介绍：蛋白质含量测定的方法
蛋白质含量测定的方法-考马斯亮蓝等-来自网络  
2010-05-11 21:46:05|  分类: 试验技术方法|  标签: |字号大中小 订阅    来源:丁香园
 
一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,。
二、双缩脲法(Biuret法)
蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中,蛋白质与Cu2+形成紫色络合物,此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比,而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10ug蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、Folin—酚试剂法(Lowry法)
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂配制较为困难,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:?在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的含量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(%),硫酸钠(1%),***钠(1%),三***乙酸(%),乙醇(5%),***(5%),***(%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时,加Folin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
四、紫外吸收法
由于蛋白质分子中,酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度与蛋白质含量成正比,可用作定量测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,利用280nm进行紫外检测,来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。
此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
五、考马斯亮兰法(Brad