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活血通督汤对大鼠坐骨神经损伤基于Notch信号通路的保护作用.docx

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活血通督汤对大鼠坐骨神经损伤基于Notch信号通路的保护作用.docx

上传人:科技星球 2024/9/19 文件大小:28 KB

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文档介绍:该【活血通督汤对大鼠坐骨神经损伤基于Notch信号通路的保护作用 】是由【科技星球】上传分享,文档一共【9】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【活血通督汤对大鼠坐骨神经损伤基于Notch信号通路的保护作用 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。活血通督汤对大鼠坐骨神经损伤基于Notch信号通路的保护作用??谢超春,邓俊颖,刘腾鸿,周思远,蒋擎福州市中医院创伤骨科,福州350001坐骨神经损伤作为最为常见的周围神经损伤,主要临床表现为慢性疼痛,常间歇性、反复发作,缺乏特定的诱因。由于损伤神经的修复能力有限,且所需时间较久,往往在再生的神经纤维到达所支配的靶组织之前,靶组织便已经发生了不可逆的失神经性萎缩,这种情况可能影响靶组织的功能恢复,甚至会导致功能无法完全恢复,影响患者的生活质量。因此,在周围神经出现损伤后,探寻促进神经功能恢复的方法一直是临床研究中备受关注和挑战的焦点问题。目前,治疗周围神经损伤的主流方法包括手术和药物治疗。手术治疗包括神经断端的缝合、使用人工神经导管以及自体神经移植等方法。此外,药物治疗方面,采用神经营养药物有助于促进神经损伤的修复。联合运用中医药也被广泛应用于促进神经损伤的修复。随着现代中医药理论和药理研究的不断运用与发展,越来越多的中医学者已经验证了在治疗周围神经损伤方面,运用益气活血、化瘀通督类中药对促进周围神经的功能恢复具备独特的优势[1-2]。活血通督汤作为治疗急性神经损伤的中药经典效方之一,由我国骨伤科专家张安桢教授创制。此外,张俐教授的前期研究已充分证实,活血通督汤有助于促进神经细胞的再生和修复,对神经损伤的康复发挥了重要作用[3-4]。近年来,Notch信号通路在周围神经损伤修复方面的研究较为深入。相关研究发现该通路的激活与许旺细胞表型的转变密切相关,在损伤的周围神经组织中,许旺细胞内Notch胞内结构域(Notchintracellulardomain,NICD)的表达明显上调,说明Notch信号通路被激活,许旺细胞会迅速进入去分化过程,进而促进神经髓鞘的再生,若对其进行抑制则可能导致损伤神经髓鞘无法再生[5]。张紫微等[6]发现,补阳还五汤可以通过上调Notch-1、Split多毛增强子1(Hes1)和Hes-5基因的表达,从而影响神经干细胞,促进其向神经元及神经胶质细胞的分化。同时,高琛等[7]也发现了中药成分淫羊藿次苷-Ⅱ可以提升大鼠脑损伤组织中Notch-1的表达水平,并认为这是通过下调miR-141-3p水平反向激活Notch/Nrf-2轴产生作用的。这种作用导致脑组织含水量降低、脑梗死灶的体积减小,同时改善了血脑屏障的通透性。在上述研究的基础上,本研究的主要目的是对大鼠坐骨神经损伤后的形态学变化及与Notch通路相关蛋白Hes1和NICD的表达情况进行全面评估,以期深入了解其对神经再生和损伤修复的影响。,年龄介于6~8周,体重范围为(200±20)g。所有大鼠均购买于斯贝福生物技术有限公司,并在福建医科大学药学院动物实验中心饲养。雄鼠将根据随机数表法分为三组:假手术组、模型对照组和活血通督汤组,每组18只。(由黄芪、地龙、泽兰叶、赤芍、白芍、川芎、牛膝构成),各中药饮片购于福州市中医院,制成含生药浓度lg/m1的汤剂,无菌封装冷藏备用;另外使用了注射用青霉素钠(山东圣旺药业)。(批号:100092683)、二甲苯(批号:10023418)及中性树胶(批号:10004160);赛维尔公司提供苏木素染液(批号:G1004)、苏木素分化液(批号:G1039)及苏木素返蓝液(批号:G1040);由索莱宝公司提供伊红染色液(批号:G1120);由密理博公司提供PVDF膜()(批号:ISEQ00010)、由艾博抗(上海)贸易有限公司提供β-actin抗体(批号:ab8226);由三鹰生物技术有限公司提供NOTCH1多克隆抗体(批号:20687-1-AP);由博士德生物工程有限公司提供Anti-Hes1抗体(批号:BM4488)。(型号:KH-TS)、包埋机(型号:KH-BL);徕卡公司提供切片机(型号:RM-2235);精宏公司提供烤箱(型号:XMTD-8222)及电热恒温鼓风干燥箱(型号:DHG-924A);奥林巴斯公司提供正置光学显微镜(型号:CX23);明美光电公司提供成像系统(型号:MSX2);英特美迪科公司提供病理切片扫描影像系统(型号:IMD-Neo-5X);湘仪公司提供冷冻高速离心机(型号:H1850R);北京普朗新技术有限公司提供酶标仪(型号:DNM-9602);六一生物科技有限公司提供电泳系统及电泳槽(型号:DYY-7C);培清科技有限公司提供化学发光仪(型号:JS-1070)。,对相关器械和操作台进行消毒,提前配备术中所需溶液制剂,操作前大鼠均予8h禁食和4h禁饮处理。%戊巴比妥钠剂量,待大鼠腹腔注射麻醉成功后,于大鼠右臀部术区域备皮消毒处理。模型对照组和活血通督汤组的手术操作如下:在大鼠右臀部斜切开约2cm切口,逐层切开皮肤、皮下组织和深层筋膜,钝性分离小鼠臀部肌肉,充分显露出右侧坐骨神经。在距离梨状肌下缘5mm的位置,使用显微止血钳钳夹坐骨神经。夹压需要达到第二个扣的程度,每次维持10s,重复操作3次,每次间隔5s。确保压强达到21950Pa,造成大约2mm宽的神经损伤区域,则大鼠坐骨神经损伤模型制备完毕。使用10-0缝线标记神经损伤部位,以方便后期取材时定位。假手术组不进行钳夹操作,其余步骤一致。三组大鼠实验操作完成后,向切口处滴入1~2ml青霉素(8万单位)水溶液预防感染。随后,均被安置动物房内,接受常规的饲料喂养,自由饮水。,并且在术后继续保持灌胃直至取材时间节点。假手术组和模型对照组大鼠使用生理盐水进行适应性灌胃,活血通督汤组大鼠使用活血通督汤进行适应性灌胃。成人活血通督汤的剂量为2g/(kg·d),按比例换算,/(kg·d)。、14和28天,每个组别分别处死6只SD大鼠,在事先标记部位进行切开取材,得到大鼠损伤部位的神经组织样本。用于评估与Notch信号通路相关的蛋白Hes1、NICD的表达情况,及神经组织形态学变化的研究。在哺乳动物组织样本中,β-actin蛋白表达丰富、稳定,是已知的最保守的蛋白质之一。本研究选择将其作为内参蛋白,用于对比Hes1、NICD的表达情况。①取材、固定:神经组织标本用4%多聚甲醛固定24h以上;②脱水:使用依次浓度梯度酒精脱水;③浸蜡、包埋:将组织浸蜡,使用包埋机进行包埋;④切片、脱蜡:使用切片机切片,片厚4μm。再依次将切片放入二甲苯、无水乙醇、75%酒精,最后自来水冲洗脱蜡;⑤苏木素染色:使用苏木素染液染色、分化液分化、返蓝液返蓝,其间均需流水冲洗;⑥伊红染色:依次浓度梯度酒精脱水、伊红染液染色;⑦脱水封片:切片依次置入无水乙醇、二甲苯进行脱水,最后中性树胶封片。。随后,根据BCA法测定蛋白样品的浓度,并使用SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白样品分离,并将其转移到PVDF膜上。然后,放入5%的牛血清白蛋白,40rpm摇床,室温封闭2h。封闭完后将PVDF膜放入装有一抗(β-actin1∶1000,NOTCH11∶1000,Hes11∶1000)的抗体杂交盒中,摇床4℃孵育过夜。以确保初级抗体充分结合目标蛋白。第二天用TBST洗涤孵育好的PVDF膜,清洗完毕后,将PVDF膜放入l∶5000稀释的兔二抗杂交盒中,水平摇床上室温孵育2h;结束后同样用TBST洗涤。将PVDF膜平置于透明膜上,ThermoECL试剂盒的A液和B液等体积混合后加到膜表面,暗处静置3min后去除膜上发光液,置于透明膜上。采用凝胶成像系统发光检测,收集条带图像。ImageJ分析条带灰度值,在实验中使用β-actin作为内部对照,用于比较蛋白的相对表达水平。。对多个样本的平均数进行了单因素方差分析,而各组之间的比较则使用了独立样本t检验。统计数据以±s的形式表示,,被认为差异具有统计学意义。,表明腹腔麻醉和坐骨神经的暴露操作对大鼠坐骨神经未产生明显影响。模型组的坐骨神经组织中出现了大量空泡状改变,伴随着神经细胞的萎缩、凋亡甚至消失,并有大量炎症细胞浸润,其结构紊乱且界限不清,随着时间推移未见改善趋势。活血通督汤组的坐骨神经组织中的病理变化较模型组有明显改善,在术后第7、14、28天的分组标本形态学上呈现出改善的趋势。这表明活血通督汤对于减轻神经组织的炎症反应和对神经细胞的保护起到了一定作用。见图1。图1各取材时间节点各组大鼠坐骨神经损伤处HE染色结果(×100),各分组不同时间节点神经β-actin表达均无明显差别(均P>),与假手术组比较,模型组及活血通督汤组NICD及Hes1的表达均增加(均P<),而活血通督汤组较模型组相比,NICD及Hes1表达增加更多(均P<)。见表1及图2。表1各组大鼠坐骨神经组织NICD/Hes1通路相关蛋白表达比较图2不同时间节点各组大鼠坐骨神经损伤NICD及Hes1的Westernblotting表达情况3讨论周围神经损伤,尤其是严重的周围神经损伤,仅仅依赖手术修复难以达到使患者功能完全恢复的理想预期,临床治疗上常通过联合应用营养神经药物来进行治疗,以促进神经功能的恢复,如甲钴胺、神经生长因子等。在祖国传统医学方面,许多学者已经证实益气活血、化瘀通络类中药在治疗周围神经损伤方面具有独一无二的优势。温婷等[8]人认为臭牡丹(CBS)的茎叶具有“活血散瘀,祛风除湿,消肿解毒”的功效,能够改善“痹症”因“不通”所引起的不适,缓解疼痛。其研究结果表明,CBS可以通过促进脊髓GluN2A和GluN2B蛋白的降解,抑制NMDA受体的作用,从而缓解坐骨神经分支选择性损伤诱导的大鼠神经病理性疼痛,因而促进运动功能的改善与恢复。孙文博及其团队[9]在临床实践中发现,常规的西医治疗与自拟通络散联合应用,能有效降低化疗引发的周围神经损伤患者的疼痛和麻木程度,提升生活质量。此联合治疗不仅能调节感觉-运动神经传导,还能抑制促炎因子的分泌,显著降低不良反应,疗效显著。Notch信号通路由Notch配体、Notch受体、DNA结合蛋白CSL以及其他效应分子和调节分子共同组成,共同作用。Hes1和ASCL1是Notch信号通路的重要下游效应分子。这两者相互拮抗,以维持适当数量和比例的神经胶质细胞和神经元细胞。提高Notch信号通路的表达水平有助于周围神经元的再生,还可以通过介导免疫炎症损伤影响细胞凋亡[10]。中草药因其天然来源、较少不良反应以及配伍灵活性等特点,既可作为主药,也可作为辅助药物,以提高其他药物的功效。这符合目前多模式协同治疗的趋势,因此具有广阔的开发前景。祖国医学在急性脊髓损伤的临床诊疗中,具备一定的临床经验,我国骨伤科专家张安桢教授的经验效方活血通督汤对于神经修复的临床治疗效果显著。在本研究中,仅进行单纯切开显露坐骨神经的操作,并未对坐骨神经的HE形态学表现或相关蛋白Hes1和NICD的表达产生影响。而随着给药时间的延长,活血通督汤组相较于模型对照组显示出坐骨神经损伤HE形态学改善的变化更为明显。在通过对Notch信号通路相关蛋白Hes1和NICD的表达效果进行评估时,结果我们发现在术后第7、14、28天,模型对照组和活血通督汤组的患侧坐骨神经中Hes1和NICD的表达效应均出现不同程度的增加。然而,活血通督汤组的相关蛋白表达相较于模型对照组有明显的升高,并且这种差异具有统计学意义。此外,本研究还我们观察到Hes1和NICD的表达也呈现出与给药时间相关的特性。随着给药时间的延长,Hes1和NICD的表达呈现出逐渐增强的趋势基于本研究结果,提示活血通督汤有助于促进坐骨神经损伤的修复,这种疗效可能与Notch信号转导通路有关。然而,本研究结果还需要进一步展开更为全面的实验研究及临床试验来验证活血通督汤在治疗坐骨神经损伤方面的实际效果,为临床治疗提供更为可靠的证据支持。?-全文完-

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