文档介绍：核酸的提取与鉴定
研究对象:基因组DNA、质粒DNA、
总RNA、mRNA等
过程:
核酸提取
裂解:破碎细胞,使细胞中的核酸游离在裂解体系中
纯化:使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离
核酸提取的主要步骤:
破碎细胞
提取
纯化

——内容物释放
、纯化
,并去除杂质
 

总原则:

①应保证核酸一级结构的完整性;
②排除其它分子的污染。
鉴定:浓度、纯度、完整性
鉴定技术:分光光度技术、凝胶电泳技术
第一节预处理
一、样品预处理
1、组织
组织有新鲜组织、甲醛固定或石蜡包埋组织。
新鲜组织先用生理盐水洗,然后将其捣碎或剪碎,加液氮研磨成粉状,加细胞裂解液裂解细胞;
甲醛固定组织要先去掉甲醛;
石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。
2、培养细胞
培养细胞需弃细胞培养液,用缓冲液进行多次漂洗,方可用于提取核酸。
3、血液
血液可以是新鲜血液或者冻贮血液;
注意抗凝剂的选择,一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠,不可使用肝素;
全血离心弃血清(或血浆)、加适量的红细胞裂解液(破膜液),裂解红细胞,再加适量的细胞核裂液(破核液),裂解白细胞中的细胞核,使核内DNA 释放出来。
二、提取用具预处理
(一)DNA提取用具的处理
试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。
(二)RNA提取用具的处理
1、提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
塑料制品:使用灭菌的一次性用品。%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。
玻璃用品: 使用前于180℃的高温下干烤6h以上,或在220℃下干烤3h以上。
有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3%H2O2室温浸泡10min,%DEPC水冲洗,晾干。
所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
严格来说,%DEPC于37℃处理12小时以上,然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟,去除残余DEPC。