PCR-扩增.doc

文档介绍：PCR-扩增
一、实验目的
学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;
深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。
二、实验原理
多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )
原理类似于DNA的变性和复制过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。
PCR 反应系统的组成
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
   
三、材料与试剂
PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等

2X Taq Master Mix; DNA 模板;引物F;引物R;PCR水;
四、实验步骤
PCR反应体系(10ul)
成份
体积
2X Taq Master Mix
ul
模板DNA
ul
引物F
ul
引物R
ul
PCR水
ul
总反应体系
10 ul
PCR条件
94℃变性5min后开始以下循环:(盖子温度升至99℃)
94℃变性反应30 sec;
55℃退火反应30 sec;(根据引物确定温度,部分45℃)
72℃延伸反应50 sec;
进行35个循环;
最后72℃反应5min;
16℃保存
4℃冷却恒定。
五、PCR产物分析
取3-5ul PCR产物,%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。
六、PCR结果