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百川东到海，何时复西归?少壮不努力，老大徒伤悲。——汉乐府
常见的三种微生物染色方法
学院：生命科学 专业：生物科学 ···2025 级 姓名：王亚军
摘要：在用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，
借助于颜色的反衬作用， 可以更清楚地观察细菌的形状及某些细胞的
结构。通过对细菌的简单染色可初步认识细菌的形态特征； 通过革兰
氏染色可将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性;通过对细菌的芽孢染
色可初步了解芽孢杆菌的形态特征。 通过这三种常见的微生物染色方
法，可对微生物的形态结构进行观察。
关键词 ：染料 革兰氏染色 无菌技术 芽孢
引言：学会油镜的使用；学会对细菌进行涂片；学习无菌操作技术；
学会革兰氏染色法及芽孢染色法； 了解芽孢杆菌的形态特征， 观察押
宝的形态、大小、着生位置。
用于为生物染色的染料， 是一类苯环上带有发色基团和助色基团
的有机化合物。发色基团赋予化合物颜色的特征，助色基团则给予化
合物能够成盐的性质仅含发色基团的苯化合物（称色原） 即使带有颜
色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生
物没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分
酸性染料和碱性染料两大类，但在微生物染色中，碱性染料较常用。
常用的碱性染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿等。
实验内容：
一、细菌的简单染色
1、 原理： 在中性、 碱性或弱酸性溶液中， 细菌细胞通常带负电荷， : .
志不强者智不达，言不信者行不果。——墨翟
碱性染料在电离时，其分子染色部分带正电荷，因此碱性染料的
染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。故可用单一的碱性染料
对细菌进行染色。
2、 器材：
（1）仪器：显微镜、酒精灯等
（2）实验材料：
菌种：枯草芽孢杆菌
四联球菌
染色剂：齐氏石碳酸复红染液
3、 操作步骤：
（1）先将载玻片洗净，擦干。
（2）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无
菌从斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂成薄膜，越薄越好，注
意取菌不要太多。
（3）晾干：让涂片自然晾干。
(4)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不
烫手为宜）。
(5)染色：滴加染液于涂片上，然也刚好覆
盖涂片薄膜即可。 : .
老当益壮，宁移白首之心；穷且益坚，不坠青云之志。——唐·王勃
（6）水洗：倒去染液，用水冲洗，直到流下
的水为无色。
（7）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高
倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴， 将油镜头浸入油滴中仔细调焦观
察细菌的形态。
结果：通过油镜可看到枯草芽孢杆菌呈杆状、线状排列。四联球菌常
四个球菌排成方形。
二、革兰氏染色法
1、原理
由于细菌细胞壁的结构和组成不同， 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏
阳性和革兰氏阴性。 当用结晶紫初染后， 所有细菌都被染成初染剂的
蓝紫色。典作为媒染剂，它能于结晶紫结合成结晶紫--典的复合物，
增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效
果是不同的。 革兰氏阴性细菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的
类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂
质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，
结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高， 类脂质含量少， 经脱
色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低， 因此细菌仍保
留初染时的颜色。 : .
勿以恶小而为之，勿以善小而不为。——刘备
2、器材：
（1）仪器：显微镜、酒精灯等
（2）实验材料：
菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌
染色剂：草酸铵结晶紫染液、番红
媒染剂：碘液
脱色剂： 95% 乙醇
3、操作步骤
（1）涂片 （2）晾干 （3）固定
（4）结晶紫染色：加适量（以盖
满细菌涂面）的结晶紫染色
液染色 1 分钟；
（5）水洗：倾去染色液，用水小
心地冲洗。
（6）媒染：碘液，媒染 1min ；
（7）水洗：用水洗去碘液。
(8)脱色：将玻片倾斜，连续滴加 95% 乙醇脱
色 10s-18s 至流出液无色，立即水洗。
(9)复染：滴加番红复染 2min ；
(10)水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。
(11) 晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。
(12)镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 : .
非淡泊无以明志，非宁静无以致远。——诸葛亮
后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染
色反应性。
4、 结果：用油镜观察可看到枯草芽孢杆菌呈紫色， 为革兰氏阳性
菌;大肠杆菌呈微红色，为革兰氏阴性菌。
三、细菌芽孢染色法
1、原理：
芽孢壁厚、透性差、不易着色，无法用单染色的方法使其着色
用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色， 使
染料不仅进入菌体也可进入芽孢内， 进入菌体的染料经水洗后被脱
色，当用对比度大的复染色剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是
芽孢和菌体更易区分。
2、器材：
（1）仪器：
显微镜、试管、电炉等
(2)实验材料：
菌种：枯草芽孢杆菌
巨大芽孢杆菌
染液：苯酚品红 黑墨水
3、操作步骤：
（1）制备菌悬液：加 10 滴无菌水于小试管内，用接种环挑取 2-3 环
菌苔于试管内，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。 : .
古之立大事者，不惟有超世之才，亦必有坚忍不拔之志。——苏轼
（2）染色：加苯酚品红染液 15-18 滴于小试管内，并使其与菌液混
合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中， 加热染色 8-10 分钟。
（3）涂片固定：用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，
涂成薄膜，然后将涂片通过火焰 3 次温热固定。
（4）脱色： 95% 乙醇脱色，直至流出的水无红色为止。
（5）水洗
（6）复染：用黑墨水染背景
（7）镜检：干燥后用油镜观察。
4、结果：通过油镜可看到，枯草芽孢杆菌的芽孢呈红色，营养体透
明。芽孢有的着生在杆菌的中间部位，有的着生在靠近杆菌端部，巨
大芽孢杆菌的芽孢也呈红色， 营养体也透明，但巨大芽孢杆菌的芽孢
比较大，含芽孢的巨大芽孢杆菌菌体膨大变形，呈圆柱形，芽孢居于
营养体中间。
讨论：
。如脱色
过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性
菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被
染成革兰氏阳性菌。
。若菌龄太老，由于菌体死亡
或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
，会造成假阴性或假阳性。
参考文献： : .
去留无意，闲看庭前花开花落；宠辱不惊，漫随天外云卷云舒。——《幽窗小记》
微生物学实验（第三版） 沈萍 范秀容 李广武 主编
微生物学实验讲义 张琪
2011 年 9 月 28