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1、生物大分子的特性：
（1）由结构比较简朴的小分子所组成
（2）具有非常复杂的结构
2、生物大分子制备难度：
（1）生物材料的组成极其复杂
（2）许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的环节繁多，流程又长
（3）许多生物大分子极易失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件
（4）溶液的温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子的制备，很难准确估计和判断，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
3、生物大分子制备的通常环节：
（1）拟定要制备的生物大分子的目的和规定
（2）建立相应的可靠的分析测定方法
（3）通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子的物理化学性质
（4）生物材料的破碎和预解决
（5）分离纯化方案的选择和探索
（6）生物大分子制备物的纯度的鉴定。规定达成一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰
（7）产物的浓缩，干燥和保存
4、蛋白质的分离纯化：
（1）材料获得：天然获得；基因工程手段获得
（2）粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白
（3）细分离：常压柱层析：分子筛层析、离子互换层析、疏水层析、亲和层析
（4）鉴定：纯度、浓度、活性
5、蛋白质的结构研究：
（1）一级结构：氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析
（2）二级结构：紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性法、红外光谱法、激光拉曼光谱法
（3）高级结构：X-射线衍射法、核磁共振法
（4）结构与功能的关系：突变、晶体分析、蛋白与蛋白的互相作用
6、酶活力：酶催化一定化学反映的能力。
7、酶活力单位：每分钟催化生成一微摩尔产生所需要的酶量为一个酶活力单位。
8、制备生物大分子的方法：
（1）以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等
（2）以溶解度的差异为依据的方法：盐析。萃取、分派层析、选择性沉淀和结晶等
（3）以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子互换层析等
（4）以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等
9、酶的比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位娄，是酶制剂纯度的一个指标
10、回收率：纯化过程中酶活性的收率
11、纯化位数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值
增大纯化位数和缓慢减少回收率的方法属于有应用价值的方法。
12、蛋白质的鉴定：
（1）浓度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法
（2）纯度：电泳法、化学法、仪器法
（3）分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳
（4）等电点：等电聚焦电泳
（5）活性：激酶、磷酸化酶、运用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。
二、沉淀法
1、沉淀法：
纯化大分子物质的一种经典方法。
操作简朴，成本低廉。不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，可以有选择性的沉淀杂质或有效成分。
原理：不同物质在溶剂中的溶解度不同而达成分离的目的 (又称溶解度法)
改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中各种物质的溶解度发生变化。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。然后通过适当解决，即可达成从抽提液中分离有效成分的目的。
2、沉淀可以分为可逆性沉淀和不可逆性沉淀
可逆性沉淀：在沉淀过程中，有效成分结构和性质都没发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化有效成分的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。
不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，并且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀物不也许再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。（沉淀物一般是杂质）
3、常用的沉淀方法和沉淀剂：
（1）盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
（2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸类产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。
（3）等电点沉淀法：用于氨基酸，蛋白质及其他两性物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结合使用。
4、制备蛋白质：
（1）盐析法：
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
1-1．优点：①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简朴、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增长，称为“盐溶”现象。
但中性盐的浓度增长至一定期，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。
由于中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
1-2．二步法
（如0～35%饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。pH应偏离有效成分的pI值，靠近杂质的pI值。经离心分离后得到上清液.
（如35%～55%饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，pH应调至接近有效成分的pI值。用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。
1-：硫酸铵。
优点：① 溶解度大，对温度不敏感
② 分离效果好
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用
④ 价格便宜，废液不污染环境
缺陷：样品欲继续纯化，需花一定期间脱盐。
1-：
（Ks）；（lgS（溶解度）=β-Ks·M（盐的浓度），Ks为盐析常数,其数值大,表达分级范围窄,盐析效果好）
；（盐析范围（盐离子强度）差异明显，分离效果好）
；（pH值常选在该蛋白质的等电点附近）
；（蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，%～2%为宜。）
（对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小）
1-：凝胶过滤、透析。
（2）有机溶剂沉淀法：
1-：有机溶剂能减少水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质分子间的互相作用力，增长了蛋白质分子间的互相作用，导致蛋白质溶解度减少而沉淀。
基本原理2：有机溶剂与水互溶,从蛋白质分子周边的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
1-：
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。
缺陷:
对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
1-3．有机溶剂的选择:要能与水互溶。
沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。
有机溶剂浓度的计算 ：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积
V0 = 原溶液体积
S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度
S2 = 所规定达成的有机溶剂的浓度
100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2) 项应改为 (95－S2) 。
（3）蛋白质沉淀剂：所用的试剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用。
碱性蛋白质、凝集素（优点：反映条件较温和，专一性强）、重金属（要控制在较温和的条件下进行）。
（4）聚乙二醇沉淀作用：
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用．
在生物大分子制备中，沉淀作用较满意的聚合物是分子量在400～6000之间的聚乙二醇． 优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀效能高；沉淀后有机聚合物容易去除。
（5）选择性变性沉淀法：
运用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变化沉淀而得到分离提纯。热变性、表面活性剂和有机溶剂变性、选择性酸碱变性。
（6）晶体沉淀法：蛋白质结晶形成过程。
5、制备核酸：
从生物材料中分离出的DNA或RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在的。因此，制备核酸时，需先将这些复合物进行解聚，除去蛋白质，分离DNA与RNA,然后再通过沉淀法得到核酸。
（1）DNP/RNP复合物的解聚：去污剂（SDS等可使膜蛋白和脂肪溶解，随后加入适量的乙酸钾溶液以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋白质）、有机溶剂（有机溶剂如苯酚、氯仿是蛋白质的一类变性剂，上层水相为核酸）、蛋白水解酶（可避免剪切和破坏核酸）
（2）DNA与RNA的分离：酶水解法（提取DNA时，可用RNase水解RNA杂质）
（3）核酸的沉淀：乙醇-盐溶液（加入NaAC或NH4AC以及2倍体积（对DNA）（对RNA）的冷无水乙醇，就可将核酸沉淀出来）、异丙醇（-1倍体积的异丙醇，离心即可得到核酸沉淀）
三、层析法
1、层析技术：
亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。是运用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同限度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达成分离。
2、共同特点：
①色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。
②色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。
③被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。
3、常用术语：
（1）色谱柱：装有固定相的管子玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱
（2）固定相：层析的一个基质，可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子互换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，互换等作用。
（3）流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。
构成柱层析的流动相的溶液涉及：平衡液（用于柱平衡、溶解样品的缓冲液）、洗涤液（作为洗去杂质的溶液）和洗脱液（改变洗涤液的组成作为洗脱有效成分的溶液）。
（4）层析:当流动相中样品混合物通过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相互相作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的顺序从固定相中流出。
（5）操作容量（互换容量）：在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反映达成平衡时，存在于基质上的饱和容量。（数值越大，表白基质对该物质的亲合力越强。）
（6）分派系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。用K表达。
K=溶质在固定相中的浓度 / 溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm
凝胶层析，分派系数实质上表达某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分派关系。
（7）迁移率（比移值）：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相自身移动的距离之比值。用Rf表达。K ↑ → Rf ↓
（8）Vt＝Vo＋Vi＋Vg
Vo:外水体积，是指凝胶柱中凝胶颗粒周边空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。即柱床内凝胶颗粒外空隙之间的水相体积。可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，比如蓝色葡聚糖-2023，分子量为200万，所有型号凝胶都会排阻
Vi：内水体积，是指凝胶颗粒中孔穴的体积，固定相体积就是指内水体积。即凝胶颗粒内部所含水相体积。可用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯或其它与凝胶无吸附力的小分子物质测定。
Vg：基质体积，是指凝胶颗粒实际骨架体积。即凝胶自身的体积。
Vt：床体积，就是指凝胶柱所能容纳的总体积。πr2h。
Ve：洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积，即自加入样品时到组分最大浓度峰出现时所流出的体积。
大分子先被洗脱出来，Ve值小，Kav值也小；而小分子后被洗脱出来，Ve值大，Kav值也大。
对于完全排阻的大分子，Ve＝Vo， Kav＝0；而对于完全渗透的小分子，Ve＝Vt， Kav＝1。
一般Kav值在0－1之间，如Kav值大于1，则表达尚有些物质与凝胶有吸附作用，则Ve>Vt 。
(9)塔板理论：
假定：
1）塔板之间不连续；
2）塔板之间无分子扩散；
3）组分在各塔板内两相间的分派瞬间达至平衡，
达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；
4）某组分在所有塔板上的分派系数相同；
5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。
当塔板数n较少时，组分在柱内达分派平衡的次数较少，曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n>50时，峰形接近正态分布。
理论塔板数：
可得理论塔板高度 H 越小、理论塔板数 n 越多、色谱峰越窄，则柱效越高。分离度也大，从而提高了柱效 .
(9)速率理论：