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天津医科大学
基础医学院
生物化学与分子生物学系
辛灵彪
2021
2022
2023
目 录
目的要求
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3
什么是质粒（plasmid）？
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01
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质粒有哪些构型？
03
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质粒的用途有哪些？
05
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质粒的本质是什么？
02
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质粒有哪些特点？
04
4
质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。
在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
（3）开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
质粒的三种构型
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质粒DNA的一般特性：
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宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多
1
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它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
2
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质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。
3
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它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等
4
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解
收集方法：高速离心的方法
裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水
热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。
根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的
纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化
常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较
小及共价闭合环状的性质。
分离纯化质粒DNA的主要步骤
2 提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则
原理示意图
实验原理：
高碱
细菌的细胞壁破裂，内容物释放
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；
②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。
①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；
②双链DNA并不完全分离。
高酸中和至中性
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中
纯化
RNA酶消化除去RNA，并用除去残留的蛋白质
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试剂盒主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）
Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）