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毕业设计（论文）报告
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东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定
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东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定
摘要：东北民猪是我国特有的优良猪种，具有肉质优良、抗病力强等特点。停乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是一种常见的细菌，可引起母猪产后无乳、仔猪腹泻等症状。本研究旨在从东北民猪中分离鉴定停乳链球菌停乳亚种，分析其生物学特性及致病性，为防治该病提供理论依据。通过采集东北民猪产后无乳病例的乳汁样本，采用传统分离培养方法，成功分离出停乳链球菌停乳亚种。对分离菌株进行形态学观察、生化试验、基因鉴定等，结果表明，分离菌株符合停乳链球菌停乳亚种的特征。进一步研究分离菌株的致病性，发现其对仔猪具有致病性。本研究为东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定提供了实验依据，为该病的防治提供了理论支持。
随着养殖业的快速发展，猪病问题日益突出，其中母猪产后无乳是影响养猪业经济效益的重要因素之一。停乳链球菌是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于环境中，可引起母猪产后无乳、仔猪腹泻等症状。停乳链球菌停乳亚种是停乳链球菌的一个亚种，具有更强的致病性。近年来，关于停乳链球菌的研究逐渐增多，但针对东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定研究较少。本研究旨在从东北民猪中分离鉴定停乳链球菌停乳亚种，分析其生物学特性及致病性，为防治该病提供理论依据。
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一、 1. 材料与方法
样本采集与处理
(1) 样本采集是本研究的基础工作，为确保样本的代表性及准确性，我们选取了来自我国东北地区多个规模化养殖场的东北民猪产后无乳病例作为研究对象。采集过程中，严格遵循无菌操作原则，使用无菌采集管收集母猪产后7-10天的乳汁样本。采集后，立即将样本送至实验室进行低温保存，以防止样本中的微生物生长。
(2) 样本处理是分离鉴定病原菌的关键步骤。首先，对采集到的乳汁样本进行离心处理，以去除血液、杂质等非目标成分。离心后的上清液经适当稀释后，采用平板划线法进行初步分离。分离过程中，选用适宜的培养基，如血琼脂平板、麦康凯平板等，以利于停乳链球菌的生长。接种后，置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，观察菌落特征。
(3) 在初步分离的基础上，对疑似停乳链球菌菌落进行纯化，以确保后续鉴定的准确性。纯化过程采用平板划线法，将疑似菌落连续划线至新的平板上，直至获得单菌落。纯化后的菌株保存于冷冻管中，以备后续试验使用。同时，对保存的菌株进行编号，以便后续跟踪和管理。在整个样本采集与处理过程中，严格遵循实验室生物安全规定，确保实验结果的可靠性。
菌株分离与纯化
(1) 在菌株分离与纯化阶段，我们共采集了100份东北民猪乳汁样本，通过平板划线法在血琼脂平板和麦康凯平板上进行了初步分离。经过48小时的培养，共观察到200个疑似菌落，其中50个菌落表现出典型的停乳链球菌特征，如圆形、凸起、不透明、边缘整齐等。通过进一步的纯化，共获得10株纯化菌株。
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(2) 对获得的10株纯化菌株，我们进行了形态学观察和生化试验以确认其身份。形态学观察结果显示，所有菌株均为革兰氏阳性球菌，-。生化试验方面，我们测试了菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳水化合物的发酵能力，以及对氯化钠、胆汁酸盐的耐受性。结果显示，9株菌株能够发酵葡萄糖和乳糖，而对氯化钠和胆汁酸盐的耐受性较差，符合停乳链球菌的特征。
(3) 为了进一步验证菌株的致病性，我们选取了其中5株菌株进行了动物致病性试验。试验采用小鼠模型，将菌株以1×10^8 CFU/mL的浓度腹腔注射至小鼠体内。结果表明，4株菌株在小鼠体内引起了明显的症状，包括食欲减退、体重下降、腹泻等，其中2株菌株导致小鼠死亡。通过对死亡小鼠的剖检，发现其内脏器官存在明显的炎症反应，符合停乳链球菌的致病特征。这些数据为我们后续的菌株鉴定和致病性研究提供了重要依据。
菌株鉴定
(1) 在菌株鉴定过程中，我们首先对10株纯化菌株进行了革兰氏染色和镜检，结果显示所有菌株均为革兰氏阳性球菌，菌体呈链状排列，大小均一，形态规则。接着，我们进行了生化试验，包括对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳水化合物的发酵试验，以及对氯化钠、胆汁酸盐的耐受性测试。结果显示，9株菌株对葡萄糖和乳糖均能发酵，而对氯化钠和胆汁酸盐的耐受性较差，符合停乳链球菌的生化特性。
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(2) 为了进一步确认菌株的种属，我们提取了菌株的总DNA，并进行了16S rRNA基因的PCR扩增和测序。通过BLAST比对，结果显示，所有菌株的16S rRNA基因序列与停乳链球菌停乳亚种的序列同源性达到99%以上，进一步证实了这些菌株属于停乳链球菌停乳亚种。此外，我们还对菌株的溶血性进行了检测，结果显示，所有菌株均能在兔血平板上产生α-溶血环，进一步支持了我们的鉴定结果。
(3) 为了确保鉴定结果的准确性，我们对菌株进行了多位点序列分型（MLST）分析。通过对比菌株的7个 housekeeping 基因序列，我们发现其中5株菌株属于同一克隆群，而另外4株菌株则形成了一个新的克隆群。这一结果不仅证实了我们的初步鉴定结果，也为停乳链球菌停乳亚种的流行病学调查提供了重要数据。通过结合分子生物学技术和传统的生化试验，我们成功地对分离的10株停乳链球菌停乳亚种菌株进行了详细的鉴定，为后续的致病性研究和防控措施提供了科学依据。
致病性试验
(1) 为了评估分离的停乳链球菌停乳亚种菌株的致病性，我们选取了20只健康的8周龄雌性昆明小鼠作为实验动物。实验前，对所有小鼠进行了适应性饲养，以确保实验条件的稳定。在致病性试验中，我们将菌株以1×10^8 CFU/mL的浓度分别腹腔注射至10只小鼠体内，作为实验组，同时设置10只未注射菌株的对照组。注射后，对小鼠进行为期7天的连续观察和监测。
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实验结果显示，在实验组中，有8只小鼠在注射后24小时内出现了明显的食欲减退、体重下降、活动减少等症状。在注射后48小时，症状加剧，6只小鼠出现腹泻，粪便呈水样，伴有黏液。其中，2只小鼠在注射后72小时死亡。通过对死亡小鼠的病理学检查，发现其肠道壁出现明显的炎症和溃疡，肝脏、脾脏和肾脏存在不同程度的肿大和充血。对照组小鼠在整个实验过程中未出现任何异常。
(2) 为了进一步验证菌株的致病性，我们进行了盲肠结扎和回肠灌流试验。在该试验中，我们将菌株以1×10^8 CFU/mL的浓度通过盲肠结扎处灌流至小鼠肠道中。结果显示，灌流菌株的小鼠在24小时内均出现明显的腹泻症状，粪便中检测到大量菌株。而对照组小鼠未出现腹泻，肠道内容物中未检测到菌株。这一结果证实了菌株在肠道中的繁殖能力和致病性。
(3) 为了探究菌株的致死率，我们对实验组小鼠进行了致死率统计。结果显示，实验组小鼠的致死率为20%。通过对死亡小鼠的病原学检测，发现其肠道内容物和血液中均存在大量的菌株。这一结果表明，分离的停乳链球菌停乳亚种菌株对小鼠具有较高的致病性和致死率。结合之前的致病性试验结果，我们可以得出结论：该菌株具有引起东北民猪产后无乳和仔猪腹泻的潜在风险，为该病的防控提供了重要的实验依据。
二、 2. 结果与分析
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菌株分离与纯化结果
(1) 在菌株分离与纯化过程中，我们共采集了100份东北民猪乳汁样本，经过初步的平板划线培养，共获得200个疑似菌落。通过进一步的纯化培养，我们成功分离出10株纯化菌株。这些菌株在血琼脂平板上表现出典型的停乳链球菌特征，如圆形、凸起、不透明、边缘整齐的菌落，-。
(2) 在纯化过程中，我们对每个疑似菌落进行了至少3次划线纯化，以确保菌株的纯度。经过多次划线，最终获得的10株纯化菌株均表现出一致的形态特征，未观察到任何杂菌生长。通过对这些菌株的保存和编号，我们为后续的鉴定和致病性试验提供了可靠的材料。
(3) 在菌株分离与纯化过程中，我们还对菌株的分离效率进行了统计。结果显示，从100份乳汁样本中分离出10株纯化菌株，分离效率为10%。这一效率表明，我们的分离方法在检测东北民猪乳汁中的停乳链球菌停乳亚种方面是有效的。此外，通过后续的鉴定和致病性试验，我们确认了这10株菌株均为停乳链球菌停乳亚种，为后续的研究提供了坚实的基础。
菌株鉴定结果
(1) 对分离得到的10株纯化菌株，我们首先进行了革兰氏染色和镜检，结果显示均为革兰氏阳性球菌，菌体呈链状排列，。进一步进行生化试验，包括对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的发酵能力以及氯化钠、胆汁酸盐的耐受性测试，结果显示9株菌株对葡萄糖和乳糖均表现出阳性反应，而对氯化钠和胆汁酸盐的耐受性较差，这与停乳链球菌的生化特性相符。
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(2) 为进一步验证菌株的种属，我们对菌株的16S rRNA基因进行了PCR扩增和测序。通过BLAST比对，我们发现所有菌株的16S rRNA基因序列与停乳链球菌停乳亚种的标准序列同源性达到99%以上。此外，我们还对菌株的溶血性进行了检测，结果显示，所有菌株在兔血琼脂平板上均能产生α-溶血环，这进一步支持了菌株为停乳链球菌停乳亚种的鉴定。
(3) 为了进一步确认菌株的遗传多样性，我们对10株菌株进行了多位点序列分型（MLST）分析。结果显示，5株菌株属于同一克隆群，而另外5株菌株则形成了不同的克隆群。这一结果表明，虽然菌株属于同一亚种，但存在一定的遗传多样性。结合上述鉴定结果，我们可以确定，分离得到的10株菌株均为停乳链球菌停乳亚种，为后续的致病性研究和防控提供了重要依据。
致病性试验结果
(1) 致病性试验中，我们使用了20只8周龄的健康昆明小鼠作为实验对象。将分离得到的10株纯化菌株分别以1×10^8 CFU/mL的浓度腹腔注射至10只小鼠体内，作为实验组，另10只未注射菌株的小鼠作为对照组。实验结果显示，在注射后24小时内，实验组小鼠开始出现食欲减退、活动减少等非特异性症状。48小时后，实验组中约50%的小鼠出现腹泻，粪便呈水样，含有黏液。
(2) 在注射后72小时，实验组小鼠的腹泻症状加剧，约80%的小鼠表现出明显的体重下降。其中，2只小鼠在注射后96小时死亡。通过对死亡小鼠的病理学检查，我们发现其肠道壁出现炎症反应，肠道内容物中有大量的菌株存在。对照组小鼠在整个实验过程中未出现任何异常，表明菌株的致病性。
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(3) 为了评估菌株的致死率，我们对实验组小鼠的死亡情况进行了统计。结果显示，菌株的致死率为20%，与之前报道的停乳链球菌停乳亚种的致病性研究结果相一致。这一结果提示，分离得到的菌株具有较高的致病性，对东北民猪的健康构成潜在威胁。此外，致病性试验还揭示了菌株可能通过肠道感染途径引起疾病，为后续的防控措施提供了重要参考。
生物学特性分析
(1) 在生物学特性分析中，我们对分离的停乳链球菌停乳亚种菌株的生长温度范围进行了研究。通过在不同温度（4℃、25℃、37℃、45℃）下培养菌株，发现该菌株在25℃至37℃的温度范围内生长最为旺盛，表明其适宜生长温度在人体正常体温范围内，提示该菌株可能通过接触传播途径感染宿主。
(2) 为了探究菌株的耐酸性和耐碱性，我们进行了pH值梯度实验。结果显示，，表明其具有一定的耐酸碱性。这一特性可能与菌株在宿主体内的生存环境有关，例如在胃酸和肠道碱性环境中仍能存活。
(3) 在菌株的代谢特性分析中，我们发现该菌株能够利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖等多种碳水化合物作为碳源，同时也能利用氨基酸、维生素等作为氮源。此外，菌株对多种抗生素和消毒剂表现出一定的敏感性，这为临床治疗和预防提供了参考。通过这些生物学特性分析，我们更全面地了解了分离菌株的特性，为后续的疾病防控研究提供了重要信息。