文档介绍：G418筛选相关
G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等12个级别, 培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。
,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G418,很快会形成优势的。
,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。
转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,
目的蛋白表达有的多,有的少,
外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,
在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,
长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,
转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。
所以,要进行单克隆化操作,
使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,
也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200cell左右就可以进行该操作了,
该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,
我就不赘述了。
必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,
我前十代都是这样的,
结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。
现在很多代了,很稳定。
,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过FISH验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位DNA立体结构都是相关的,装入了SV40只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完GFP的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。neo基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时,neo表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。
2。那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为0的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓100个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是neo,黄球就是你的目的基因。我们用neo,实际上是筛选的