文档介绍：表达纯化GST融合蛋白
(准备工作:灭离心管上面没有刻度,有塞子的管子。很小的三角烧瓶,用锡箔纸封口)
(1)已经转化的菌液,或者重新转化BL21(DE3)pLysS
(2)活化:取20μl菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h)
(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存)
(4)37°C,250 rpm,1 h 10 min-1 h 20 min,OD600 -()
(5)取1ml菌液作为诱导前对照,冰上放置
(6)加入IPTG,终浓度1 mM
(7)30°C,250rpm,诱导适当时间(预实验确定)章foxa2 16℃过夜 sirt1 25℃过夜
(8)取1ml菌液作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,收集菌体,加入100μl 1×SDS上样缓冲液
(9)其余菌液,分为两份,倒入50ml离心管,5000rpm,离心20 min,收集细胞
(10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体,转移小烧杯中(无气泡)注:配GST时最后加PMSF能够减少很多泡沫。加PMSF,蛋白酶抑制剂,溶菌酶。
(11)超声破碎细胞:超声3s,间隔10s,40次左右,超声强度200-300W(冰浴)
(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中,4°C,13000rpm,离心20-30min
(13)将上清转移到1个50ml离心管中,取出50μl,加入10ul 5×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)
(14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬,取出50μl,加入50μl 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)
(15)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min
(16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适,30μl上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀注:如果蛋白在沉淀中说明形成包涵体,不容易纯化。
(17)考马斯亮蓝染色
(18)电泳的同时混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry),取200μl加入15ml离心管中(2份)
(19)加入10ml PBS,混匀,3000rpm,离心3min,弃上清
(20)加入超声后上清液,4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)
(21)4°C,3000rpm,离心3min
(22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)GST裂解液加PMSF,DTT,蛋白酶抑制剂。每次4℃摇床7分钟,3000rpm离心5分钟。
(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)
(24)弃上清,加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油),混匀
(25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE(煮蛋白的时候,蛋白就会从GST珠子上掉下来离心上样时吸取上清)
(26)-20°C保存beads
(如果就是纯化蛋白不做下面的pull down就用GSH洗珠子,让其竞争性结合珠子,摇床离心取上清,蛋白要-80℃取上清,最后将上清