文档介绍：实时定量PCR (real-time quantitative PCR)
报告人:杨霞
时间:2012-5-11
目录
一、实验原理
二、实验优点
三、实验缺点
四、实验应用
五、实验简介
实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。
评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选cDNA文库的前提下,完成对cDN***段的克隆
一、实验原理
该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图( 如下图) 。
实时荧光扩增曲线图
三、实验缺点
实验费用贵
实验重复次数多:生物重复和技术重复
四、应用
科学研究:医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。
临床疾病诊断:
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。
动物疾病检测:
禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。
食品安全:
食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。
应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
五、实验简介
定量PCR试剂体系
试剂
初始浓度
终浓度
加入体积(μL)
Buffer
10 ×
1 ×

dNTPs
2 mM
200 μM

Mg2+
25 mM
4 – 6 mM
4 - 6
Primers
20 μM
400 – 800 nM
- 1
Probe / sybr green
10 μM
120 – 200 nM
–
Taq
5 U/μL
U

Template
1-20 ng/μL
5 – 100 ng
5 μL
ddH2O
补足 25 μL