文档介绍：模块一重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定
模块二植物遗传转化
模块三转化烟草的鉴定
前言
分子生物学与基因工程实验技术
模块一重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定
实验一质粒DNA的提取和电泳检测 实验二重组质粒的构建:酶切、目的片段回收、连接 实验三大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四重组质粒的鉴定
1952, J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants.
质粒是一种小的双链环状DNA分子,是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
背景知识
1. 质粒与载体
用于基因克隆的载体
必须具备的条件:
1)能够在寄主细胞内独立自主复制;
2)具有可检测的选择性标记;
3)具有多克隆位点;
4)具有较高的外源DNA的载装能力;
5) 具有针对受体细胞的可转移性。
载体种类:有来自大肠杆菌的质粒、λ噬菌体、 M13噬
菌体、噬菌粒外,还有酵母、细菌人工染色
体载体以及动、植物病毒载体。
①是染色质外的双链共价闭合环形DNA(covalently closed circular cDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300 kb之间,<15kb的小质粒比较容易分离纯化,>15kb的大质粒则不易提取。
②能自主复制,是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。
Characteristics of plasmids
③质粒对宿主生存并不是必需的。
Relaxed manner – pMB1/colE1复制子
质粒的应用
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
大多数基因工程使用松弛型质粒。
pGEM®-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference points
T7 RNA polymerase transcription initiation site 1
SP6 RNA polymerase transcription initiation site 123
T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 2982–3
SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 121–140
lacZ start codon 162
lac operator 182–198
β-lactamase (Ampr) coding region 1319–2179
phage f1 region 2363–2818
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2939–2955
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158–174
常用质粒