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(polymerase chain reaction，PCR)
PCR是体外迅速扩增目的DNA序列的技术
1971年Khorana等提出“在体外经DNA变性，与合适引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。
1983年Mullis发明了PCR技术。
1988年Saiki等将耐热Taq DNA聚合酶引入了PCR技术。
1989年PCR被美国《Science》杂志列为十余项重大科学发明之首。
1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖。
应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。
第一节 PCR原理
①遵照DNA体内复制原理，半保留式扩增；
②扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为2kb左右；
③扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段；
④30~35个循环后，目的序列呈指数级扩增(2n-2)
Cycle #1
第二节 PCR反应体系
一、反应体系
20μl 反应体系
10×buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白)
dNTP(各20~200 μ mol/L)
模板DNA (~2 μg=105个分子)
引物(各20~200pmol)
MgCl2(~)
Taq DNA聚合酶(1~)
无菌ddH2O
二、反应参数
预变性：94℃ 3~5 min
变性： 94℃ 30~60 S
退火： 38~65℃ 30~60 S
延伸： 72℃ 1~2 min
终延伸： 72℃ 10min
30~35次循环
三、影响PCR的原因
1、反应成分
①引物；浓度、长度
②DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量
③dNTP；浓度、比例
④Mg2+；影响Taq DNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。
⑤反应缓冲液；，KCl能促使引物退火、但浓度不小于50mmol/L克制酶活性。
⑥模板DNA。用量，线性DNA扩增效果不小于环状DNA。
2、反应条件
①变性的温度和时间；热启动减少非特异性扩增
②退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基构成，退火温度为Tm-5℃。退火温度越高，扩增特异性越高。
③延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目的序列的长度、及延伸温度的高下。对2 kb长目的序列扩增时间多采用 1min(72 ℃时)。
四、平台效应
平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。
引起平台效应的原因：
①dNTP或引物等消耗殆尽；
②酶活性逐渐减少；
③最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；
④非特异性产物与模板的竞争作用；
⑤在高产物浓度下产物变性不完全；
⑥低浓度的非特异产物开始大量扩增。
PCR的特点：
①敏捷度高
②简便、迅速
③对样品纯度规定低
第三节 聚合酶链式反应引物设计原则
一、引物设计的总原则
提高特异性扩增，减少非特异性扩增。
二、引物设计的一般原则
①引物长度应为15~30个核苷酸，Tm靠近72℃较佳；
Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2
②引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱基以致产生二级构造；
③G＋C碱基的含量在 45％~55％左右；
④引物3’端必须与模板互补，5’端可以不互补
⑤引物中持续互补碱基应不不小于4个；
⑥引物间持续互补碱基应不不小于4个。
三、引物3’端的末位碱基
引物3’端的未位碱基：优选A，另一方面是G、C，不要选T。由于当未位碱基为T时，虽然在错配的状况下也能引起链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引起效率大大减少；若为G或C，则引起率居于其间。当然，设计简并引物时，3’端末位碱基选T会得到很好的效果。
四、引物设计软件
Primer