文档介绍：酶联免疫吸附测定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA )
抗原-抗体反应的特点与影响因素
反应条件: 自身因素:
环境因素:
适宜温度
电解质
酸碱度
特点:
特异性
可逆性
最适比例
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凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。
沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。
补体参与的反应
免疫标记技术(immunolabelling technique):用示踪物质标记抗原或抗体,进行抗原-抗体反应的检测。
抗原-抗体反应的基本检测方法
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用示踪物质标记抗体或抗原,使其与相应的抗原或抗体反应,使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
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用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
免
疫
荧
光
技
术
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ELISA的原理
E
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间接ELISA
实验目的:小鼠IgG免疫兔,检测兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价
实验材料:包被抗原:小鼠血清
待检抗体/一抗:兔抗小鼠IgG
酶标抗体/二抗:HRP-驴抗兔IgG
聚苯乙烯酶标板水浴箱
移液器枪头
包被液:
封闭液/ 封:5%脱脂奶粉(ALB)
稀释液/稀:
(磷酸盐缓冲液)
洗液:PBST(PBS+%吐温20)
显色液:四甲替联苯***(TMB)
终止液/终:2M硫酸
阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。
鼠IgG(抗原)
兔抗小鼠IgG(一抗)
HRP-驴抗兔IgG(二抗)
免疫兔
免疫驴
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操作步骤
包被:1:2000稀释的正常小鼠血清,4℃过夜
封闭:5%脱脂奶粉,37 ℃,20min
加待检抗体:倍比稀释兔抗鼠IgG抗血清,37 ℃ 15min
加酶标抗体:1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清(已稀释好) , 37 ℃ 15min
加底物液显色
→
→
→
→
洗涤:3次,1min/次
洗涤:3次,1min/次
洗涤:3次,1min/次
→
终止液终止显色(黄)
空白对照无显色
待测样品显色明显(蓝)
E
E
E
E
底物液
底物、终止液加50ul/孔
封
一抗
二抗
无色避光
从此步开始本次实验!
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倍比稀释法与加样
除第一列孔外,先在其余每孔加100ul稀释液(稀);
在第一列孔加入200ul一抗;取100ul加入第二列孔,混匀
从第二列孔取100ul液体至第三列孔;
。。。。。。
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
blank
每孔终体积为100ul,上下两排一致
一抗
1:500
1:1000
…….
1:2000
100µL
100µL
100µL
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