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基因操作主要技术原理
基因克隆酶学基础
基因克隆载体
基因分离与判定
基因表示与调整
已讲述内容
真核基因在大肠杆菌中的表达专家讲座
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讲述内容提要
真核基因大肠杆菌表示体系
大肠杆菌表示载体
真核基因在大肠杆菌中表示
影响真核基因表示效率原因
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第一节 真核基因大肠杆菌表示体系
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1. 大肠杆菌表示体系
基因工程主要目标
制备大量纯化蛋白质产物
所以，要选择能高水平表示异源真核蛋白表示系统
当前惯用表示系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等
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背景清楚，尤其是对其基因工程表示调控分子机理研究比较深入。
安全，且有各种不一样菌株和质粒载体。
已经有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表示。
培养方便、操作简单、成本低廉，所以易于进行批量生产
大肠杆菌表示系统优越性
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真核基因与原核基因差异：编码基因不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪接能力。
转录信号不一样：真核基因转录mRNA不具备结合细菌核糖体所必须SD序列；细菌RNA聚合酶不能识别真核开启子。
真核基因mRNA 5’-端有帽子结构，3’-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合能力，从而妨碍正常转录和翻译。
真核基因在大肠杆菌中表示存在许多障碍
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处理方案
将克隆真核基因插入到原核开启子下游。
从真核细胞中分离完整加工mRNA，采取反转录合成cDNA，并连接到适当载体上，能够克服内含子问题。
假如知道蛋白质氨基酸序列，且分子量不太大，能够用化学方法合成不含内含子序列寡聚核苷酸片断。
对于细菌中能降解真核蛋白蛋白酶，能够经过突变方法消除。
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许多真核基因蛋白质产物存在翻译后修饰过程：磷酸化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，所以，表示蛋白无法正确折叠，由此产生三级结构通常是不可溶，常形成包涵体，无活性。
表示真核蛋白质被细菌蛋白酶识别并降解。
真核基因在大肠杆菌中表示存在许多障碍
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2. 克隆基因正确表示基本条件
最基本条件：能够进行正常转录和翻译
转录：真核基因置于原核开启子下游
3’-末端含有转录终止子
翻译： mRNA分子含有RBS（ribosome binding site）
包含AUG或GUG和与16S rRNA 3’-末端互补
SD（Shine-Dalgarno）序列。
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另一个主要条件：编码蛋白质产物应能维持正常稳定性。
表示蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。
蛋白质三级结构形成速率与其稳定性相关。
蛋白质三级结构正确形成需要分子伴侣参加。
大肠杆菌不可能对全部外源蛋白都存在正确分子伴侣。
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