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荧光分光光度法测定药液维生素b的含量
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一、基础原理
在紫外光或波长较短可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长光 --------荧光。以测量荧光强度和波长为基础分析方法叫做荧光光度分析法。

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假设分子在吸收辐射后被激发到S2以上某个电子激发单重态不一样振动能级上，处于较高振动能级上分子，很快地（约10-12 ~ 10-14 s）发生振动松驰，将多出振动能量传递给介质而降落到该电子最低振动能级（V=0），后经由内转化及振动松驰而降落到S1电子态最低振动能级，处于S1电子态激发分子，其分子内去活化作用有以下三种路径：
2. 分子产生荧光机理
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（1）发生S1 → S0辐射跃迁而伴随荧光现象；
（2）发生S1 → S0内转化过程；
（3）发生S1 → T1体系间窜跃。而处于T1态最低振动能级激发分子，则可能发生T1 → S0辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生T1→ S0体系间窜跃。
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v = 0
isc
T1
v = 0
v = 0
2
1
1
2
2
3
1
VR
VR
VR
isc
v = 0
S1
S2
S0
1
2
P
ic
F
A1
A2
ic
分子内光物理过程
A1、A2. 吸收
F. 荧光
P. 磷光
ic. 内转化
isc. 体系间窜跃
VR. 振动松弛
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式中K为常数。所以，在低浓度情况下，荧光物质荧光强度与浓度呈线性关系。
3. 荧光强度与浓度关系
对同一物质而言，若abc << 1（＜），即对很稀溶液，荧光强度F与该物质浓度c有以下关系：
F = I0 a•b • c
式中：Фf－荧光过程量子效率；I0－入射光强度；a－荧光分子吸收系数；b－试液吸收光程。I0 和b不变时：
F = K • C
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图A为一极稀溶液，在入射光I0照射下所发生荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓溶液，入射光被液池前部荧光体猛烈吸收后而发生较强荧光，但在液池中、后个别荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到荧光强度反而更低。
4. 偏离线性关系原因
⑴内滤效应
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I0
It
F
图 A
It
I0
F
图 B
内滤效应示意图
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在浓度较高溶液中，可能发生溶质与溶质间相互作用，产生荧光物质激发态分子与其基态分子复合物或荧光物质激发态分子与其它溶质基态分子复合物，从而造成荧光强度下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子聚集体，造成荧光强度更严重下降。
⑵ 激发态分子与基态分子或其它溶质分子形成复合物，甚至产生荧光物质基态分子聚集体
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