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限制酶酶切直接分离法
PCR扩增法
从mRNA合成cDNA
化学合成法
经过构建基因文库分离法
目的基因获得专家讲座
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对已克隆在载体中目标基因，可依据目标基因两侧限制酶识别序列，选择适当限制酶酶切，取得目标基因。
（一）限制酶酶切直接分离法
注意：
目标基因内部不能有该限制酶切点，不然目标基因会被切成碎片！
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Ampr
5’AOX1
HIS4
Kanr
3’AOX1
ColE1
pPIC9K/hVEGF165
EcoR I
Not I
Bgl II
hVEGF165
Bgl II
Kb
TT
S
Ampr
5’ AOX1
HIS4
Kanr
3’ AOX1
ColE1
pPIC9K
Kb
Bgl II
Bgl II
SnaB I
EcoR I
Avr II
Not I
S
TT
f1ori
Ampr
lacZ
pGEM-T/hVEGF165
hVEGF165
Kb
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（二）PCR法扩增目标基因
利用耐热DNA聚合酶重复作用，经过变性-退火-延伸循环操作，在体外快速将DNA模板扩增数百万倍操作技术。
PCR(polymerase chain reaction)：
目的基因获得专家讲座
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以目标基因为模板，合成互补新DNA链。
双链DNA解链为单链DNA；
引物与模板单链DNA特定互补部位配对、结合；
退火：
变性：
延伸：
变性
退火
延伸
目的基因获得专家讲座
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30th cycle？
因为每一循环所产生DNA片段均能成为下一次循环模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n (n为循环次数)。
230(109)copies
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PCR技术创造--DNA操作技术革命
创造人：美国生化学家Kary B. Mullis
The Nobel Prize in Chemistry
1993
Mullis KB.
The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American.
1990,262(4):56-61,64-5.
Mullis KB.
Dancing naked in the mind fields.
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开汽车时联想：
蜿蜒崎岖山路--DNA双螺旋
行驶汽车--一小段DNA引物
1972 在加州大学伯克利分校取得博士学位
1979 进入私人生物技术企业Cetus
正式做相关PCR原理汇报
Mullis开始动手做试验
首次取得可信结果
Randall Saiki加入，结果毋庸置疑
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Cetus企业申请专利
Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N.
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science. 1985,230(4732):1350-4.
冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会
Mullis KB, Faloona FA.
Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase
catalyzed chain reaction.
Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
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Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche企业
Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science. 1988,239(4839):487-91.
1989 Science杂志将PCR列为十余项重大科学创造之首，
比喻1989年为PCR爆炸年。
Mullis离开Cetus企业
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