文档介绍：从产热斑叶阿若母中纯化的交替氧化酶与***酸的相互作用
关键词:交替氧化酶,作用机制,***酸调节,酶的稳定性,二铁羧酸盐蛋白,产热作用
摘要:植物离体线粒体的交替氧化酶活性被羧酸调控,但是反应和调控机制还不清楚。我们的研究表明,从产热斑叶阿若母肉穗花序中纯化的AOX蛋白对***酸和乙醛酸敏感,对琥珀酸不敏感。缺乏***酸时,AOX迅速的不可逆的失活,不管杜氢酸是否开始氧化,AOX对杜氢酸不敏感。数据表明,***酸能稳定AOX的活性构象,以单独地减少底物和产物的方式增加活性蛋白的数量,这***酸对酶的表观最大速率的独特作用是一致的。
介绍
AOX是非电子激发的醌氧化酶,它位于高等植物、真菌和某些寄生虫(包括布氏锥虫和隐孢子虫)线粒体中。虽说两个独立的电磁共振研究证明AOX的活性中心由双核的铁中心组成,AOX的结构和机制已经被全部建立。近期具有说服力的傅里叶变换红外光谱学的证据坚定地把AOX归入了膜结合二铁羧酸蛋白这类蛋白中。
一项重要的发现表明,从植物中分离得到的线粒体表明某些羧酸强烈激发AOX的活性。在非产热物种的线粒体中,例如从大豆子叶和烟草叶中提取的线粒体AOX的活性完全依赖***酸的参与。乙醛酸和其他的α-***酸能代替***酸,同时,琥珀酸可以代替***酸激活土豆和产热的莲中的AOX。从产热的斑叶阿若母肉穗花序中分离的不仅表现出***酸可促进得活性,还在产热增加过程中表现出***酸不敏感的基本AOX的活性。
据推测,AOX和***酸分子间的相互作用出现在邻近的两个关键的Cys形成含硫半缩醛时,这两个关键的Cys在许多***酸敏感的AOX酶中都是保守的。人们推测,这个含硫半缩醛引起点位诱导的构象变化,这种构象变化对于激活AOX是必要的。如果用Ser替代了Cys,那么这种同功酶将不会被***酸激活而被琥珀酸激活。最重要的是,我们目前对于斑龙芋AOX的研究暗示,一系列保守序列元件很可能参与***酸的结合作用。
尽管,AOX和***酸分子间的相互作用的结构研究有一定的进展,但是,具体***酸激活AOX的机制还不清楚。人们观察到,只有线粒体泛醌库高度诱导的情况下***酸才激活AOX,因此断言,***酸增强了AOX与其还原底物的相对亲和力。自从张等发现用***酸纯化AOX,人们一直争论***酸对于AOX的最大活性具有专一性。为了把这两种观察结果解释清楚Hoefnagel 和Wiskich假想了一个模型,模型中***酸通过自身的氧化泛醌产物保护酶免受失活。我们认为用实验验证这条假说非常重要。
在这篇论文中我们阐明了AOX调控,我们用的是从斑叶阿若母肉穗花序中提取的活性高、稳定性好的AOX。我们研究表明,纯化的产热的AOX的杜氢醌(DQH2)的氧化活性对于***酸和乙醛酸敏感,而对琥珀酸不敏感。这种敏感性是由于缺乏***酸引起的不可逆的酶失活。这种失活不需要DQH2氧化,而且对DQ的形成不敏感。因此,我们的研究结果表明,***酸通过单向的减少底物和产物来稳定AOX的活性,同时,也支持了a-***酸对于AOX的表观Vmax具有独特的影响的观点。
材料和方法
N,N-Bis Pharmaceuticals购买的,其他的药品都由Sigma供应。
如上所述,AOX是从产热的阿若母线粒体中提取纯化的。简单来讲,AOX是从产热的阿若母肉穗花序中提取的,加入2 mM