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Nov 14,
新技术在医学试验中应用
新技术在医学实验中的应用
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内容提要
一 试验方法介绍
检测蛋白表示水平方法：Western blot, 2D-gel, 免疫共沉淀，Shotgun，免疫组化，流式细胞测定，激光扫描共聚焦显微，绿荧光蛋白标识法，萤光素酶标识法，ELISA.
检测DNA/RNA表示水平方法：Southern blot, Northern blot, 原位杂交, PCR.
基因操作方法: 基因敲除，基因缄默.
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内容提要
二 实用技术介绍
细胞活性检测：MTT, MTS，CCK-8, Calcein-AM.
细胞凋亡检测：Western blot, 流式，TUNEL, Hoechst 33258，DNA ladder.
活性氧自由基（ROS）检测：DCF, SOD, GSH, ESR.
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Western blot
原理：
Western blot利用了蛋白质理化性质。在一定pH缓冲液中，特定蛋白质含有固定电荷数。在电场作用下，蛋白质将按电荷数及蛋白质分子量大小在凝胶中分布。
SDS-PAGE法Western blot深入简化，SDS应用使得全部蛋白都带均匀负电荷，此时蛋白电泳距离只与蛋白分子量大小相关。
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Western blot
原理：
凝胶是由聚丙烯酰胺组成，聚丙烯酰胺浓度决定了胶中孔径大小，孔径越大，蛋白运动越轻易，越快，对大分子量蛋白分离效果好。反之亦然。测定大分子量蛋白（>１００ＫＤ）时宜用低浓度胶，测定小分子量蛋白（<３０ＫＤ）时宜用高浓度胶。另有梯度胶（比如４－１５％），能够确保在一定范围内蛋白都相对均匀分离。
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转膜方法主要分为湿转(Wet transfer)和半干转（Semi-dry transfer）。湿转速度较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，尤其对大分子量蛋白效果好。半干转特点与湿转恰好相反，对大分子量蛋白轻易转不上。
依据实际情况选择。
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Western blot
电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（NC膜或者PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。膜上非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等封闭，以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应抗体起免疫反应，再与酶,同位素或者荧光标识第二抗体起反应，经过底物显色,放射自显影或荧光成像以检测电泳分离特异性目标基因表示蛋白成份。
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示例试验步骤：
①蛋白质抽提
②蛋白浓度测定 ：
按试剂盒说明书，用BCA法测定蛋白浓度 。
③变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ：
玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；依据浓度取适量待测蛋白与5x上样缓冲液混匀后,95度变性10分钟,加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以75V（浓缩胶）及120V（分离胶）恒压电泳。
④转膜 ：
裁切与凝胶一样大小NC膜和滤纸，NC膜置于转膜缓冲液中浸泡30min以上。按次序依次放置滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，半干法以40mA恒流转膜 2 h。
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⑤抗原抗体反应:
蛋白质以脱脂牛奶封闭1h后，与一抗4℃孵育过夜，与二抗室温孵育1h，TBST洗涤4次，每次5min。
⑥显色:
加入DAB显色5min，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件Quantity one测灰度值。
显色系统各种多样。传统二抗通常是与辣根过氧化酶结合抗体，遇DAB显色或者与专用试剂盒试剂反应使胶片曝光。新型二抗与荧光物质结合，在专用荧光成像仪下读取荧光印迹，能够方便地进行多通道western blot (multiplex western blotting),免去切膜或者抗体去除步骤.
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