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------分子生物学试验技术系列讲座Ⅲ
、09、10
荧光定量PCR技术讲座
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纲领
一、荧光定量PCR技术基础理论
二、引物及Taqman探针设计
三、内参基因选择
四、反应体系优化
五、试验方案选择
六、误差分析及操作规范
七、试验中污染防控
八、试验结果分析
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一、荧光定量PCR技术基础理论
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，因为该技
术实现了PCR从定性到定量飞跃，能够对PCR反应全过程进
行实时监控，而且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短
短十几年时间，在科研及检验领域取得了广泛应用，成为
分子生物学领域不可或缺一项主要技术。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用
荧光信号伴随PCR反应积累来实时监控PCR反应进程，并通
过分析软件对PCR反应进行检测分析技术。
系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
2、荧光定量PCR惯用三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
（1）、扩增曲线及扩增曲线两种形式
左图反应是伴随PCR反应进行对应荧光信号改变，比较直观，不过指数期很短；右图反应是荧光信号改变量对数与PCR反应循环数关系，从右图可知，指数期很显著，在确定阈值线时含有简单明了特点，所以很多软件都采取右图形式，当然了，这两种实时扩增曲线能够依据试验需要相互转换。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
2、荧光定量PCR惯用三个概念
（2）、阈值线
在荧光定量PCR扩增指数期，画一条线，在此直线上，
全部样品荧光强度与其本底荧光强度差值全部相同。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
2、荧光定量PCR惯用三个概念
（3）、CT值
PCR过程中，各样品扩增产物荧光信号到达设定阈值时，所经过
扩增循环数。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
3、荧光定量PCR化学基础
荧光定量PCR是伴随PCR循环进行，以荧光信号强度积
累来实时反应PCR反应进程。理想荧光物质需具备以下特
点：
（1）、本底低
（2）、荧光强度高
（3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度增高，而且这种荧
光强度增高和每轮循环后PCR产物量成线性关系
（4）、没有PCR产物时，没有荧光
（5）、该荧光物质受激发后其发射光波长范围窄，各种
荧光不会产生荧光交叉干扰
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一、荧光定量PCR技术基础理论
3、荧光定量PCR化学基础
当前惯用几个荧光物质
（1）、Taqman探针类
5’端标识荧光基团，3’端标识淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光作用下，荧光基团产生荧光；
探针本身序列与目标基因序列互补，特异性高，退火后探针与目标基因互补序列结合，伴随PCR反应进行，在Taq酶5’---3’外切酶作用下，探针水解断裂，荧光产生。
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一、荧光定量PCR技术基础理论
3、荧光定量PCR化学基础
Taqman惯用荧光基团和淬灭基团
荧光基团：5’端惯用荧光基团FAM标识，最正确激发光波长：494-495nm，最大
发射光波长：518-520nm。
淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。
TAMRA本身也是一个荧光基团，激发光波长范围较宽，500—
560nm，最正确激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生发射光
含有很好吸收作用；其发射光波长较宽，560—650nm，当做
多重荧光时，轻易产生荧光交叉干扰，而且本底较高，故现已
不惯用。
BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一个荧光淬灭剂，本身不会
产生荧光，光吸收范围较宽，所以本底较低，作为淬灭基团较
为惯用，尤其在多重荧光定量PCR时经常被采取。
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