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鱼类细胞培养基础知识专家讲座
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一 试验项目介绍
1、试验课时 6课时
2 试验过程：
A动物细胞培养液配置
B采取组织培养法培养鱼类细胞
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二、试验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作方法，从动物体内取出所需组织(或器官)，经消化，分散为单个游离细胞，在人工培养下，使其不停地生长及繁殖。 细胞培养是一个操作繁琐而又要求十分严谨试验技术。
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鱼类细胞组培一些方法：
（1）组织块固定法
当组织量较少时可采取此法。它是将组织剪成约一立方毫米小块, 按一定百分比将组织块贴在瓶壁上, 最少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。
（2）机械分散法
此法适合用于细胞间连接较涣散组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐小块, 放入底部有一铜网注射器内, 用手压力将组织挤出网孔, 最终将分散组织吹打后加人营养液分装培养。
（3）络合剂分散法
当前使用络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接涣散, 经吹打即可分散。该法当前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系传代。
（4）酶消化法
该法是当前采取极为广泛方法, 适合用于绝大多数组织器官。所用酶主要是胰酶, %。依据酶消化时温度不一样, 又可深入分为冷消化法及热消化法。
（5）冷消化法
此法是将组织剪成约刀小块, 然后置一倍体积胰酶中, 四摄氏度培养。
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三、试验目标
1、掌握动物细胞培养缓冲液、消化液配置。
2掌握动物细胞原代培养基本过程。
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四、试验试剂
DMEM培养基
胰蛋白酶
Hanks缓冲液
抗生素溶液
牛血清
70%乙醇
去离子水
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五、试验用具
器材： 解剖剪、解剖镊、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，
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六、试验步骤
培养液配置
1、DMEM培养液配置：将1袋袋装干粉溶解于1L去离子水中，,溶解，,过滤除菌，4℃保留。
2、双抗溶液配置：将青霉素、链霉素溶解于生理盐水中，至青霉素最终浓度为100U/mL。
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六、试验步骤
3、D-Hanks缓冲溶液： 称取8gN aCl，
,,,
，高压灭菌，4℃保留。
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六、试验步骤
鱼类细胞组织培养法
1．取材： 快速处死动物，无菌分离肝脏,置D-Hanks液中,冲洗肝脏至灰白色。
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