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李扬;杨莹;张凌云;邓世明
【摘 要】,在三公膏传统工艺根底上增加酶解、离心除杂、脱油等步骤,使生产周期从 5 天 4 夜缩短到 2 天左右,出膏率由 ％左右提高到 ％,多肽含量由 ％提高到 ％;双缩脲法测定多肽含量简便、准确.
【期刊名称】《热带生物学报》
【年(卷),期】2025(009)004
【总页数】5 页(P464-468)
【关键词】三公膏;工艺改进;酶解;多肽含量测定
【作 者】李扬;杨莹;张凌云;邓世明
【作者单位】海南大学海洋学院,海口 570228;海南大学热带生物资源教育部重点试验室,海口 570228;海南大学海洋学院,海口 570228;海南大学海洋学院,海口570228;海南大学热带生物资源教育部重点试验室,海口 570228;海南大学海洋学院,海口 570228;海南大学热带生物资源教育部重点试验室,海口 570228
【正文语种】中 文
【中图分类】
三公膏是海南黎族民间流传数百年，常常用来滋补身体的补气补血佳品，具有温阳补肾、强身健体、促进生长发育等成效[1]。 三公膏传统熬制方法，通常承受足龄
公羊、公狗、公鸡，褪毛去内脏后大锅连续不断熬制 5 天 4 夜收膏而成，故称为
三公膏。依据传统工艺，通常 50 kg 左右的三公(公羊、公狗、公鸡)原料，熬制成膏后能得到 kg 左右成品。三公膏的传统熬煮工艺，不仅耗时长产率低，所得
三公膏中脂肪含量也较高，简洁变质。动物源药物含有丰富的蛋白质，蛋白质在胃、肠酶作用下，可释放出具有功能性的短肽，如二肽，三肽等，这些小肽被称为生物 活性肽，它们无抗原性，易于吸取及透过血脑屏障[2]，同时还具有调整人体生理
机能的作用，涉及人体的消化、吸取、养分代谢调控、生长发育、免疫、神经调整等各个环节[3]。目前已开发上市的有从猪脑中提取的复方脑肽节苷脂注射液，从动物脾脏中提取的多肽药物保尔佳等。还有一些产品正在研发中，例如鹿胎多肽微胶囊[4]，龟甲胶多肽[5]等。本争论基于三公膏组方和工艺特点，承受现代酶解法改进三公膏传统制备工艺，并脱脂去油，离心除杂，旨在改善三公膏的品质，提高其得率。
材料与方法
材料 三公膏(购于海南省乐东黎族自治县)，鸡肉、羊肉、狗肉(购于海口市场)， 85%磷酸、三氯乙酸、氢氧化钠、五水硫酸铜、盐酸、等均为分析纯，购于西陇
化工；木瓜蛋白酶(800 000 U·g-1,出产商 solarbio)、 胰蛋白酶(250 000 U·g-1,出产商 solarbio)、Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准品或谷胱三肽标准品。
仪器 UV756CRT 紫外可见分光光度计(上海佑科仪器)、QL-901 旋涡混合仪(金坛市期望科研仪器)、HH-4 数显恒温水浴锅(常州(梅特勒-托利多仪器(上海))、TG16-WS 离心机(湖南迈达仪器)
三公膏制备工艺路线 传统三公膏制备工艺路线：公鸡、公羊、公狗→褪毛去
内脏洗净→剁成块状→大锅熬煮→过滤→浓缩→收膏。酶解法制备三公膏工艺路线： 公鸡、公羊、公狗→褪毛去内脏洗净→剁成块状→高压锅蒸煮→分别骨肉→分别研
磨成肉糜、骨粉→合并肉糜、骨粉→酶解→过滤→离心除杂→浓缩→收膏。
酶解影响因素的优化 胰蛋白酶来自动物胰脏，水解产物大多为多肽[6]，木瓜蛋白酶是应用最广泛的蛋白酶，与前者互补，承受胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作为双酶水解用酶，用量分别为 5 000 U·g-1[7]和
7 000 U·g-1[4]。依据文献[8-9]，木瓜蛋白酶使用温度和 pH 值均较广泛。胰蛋白酶适宜弱碱性条件，其适宜温度为 40～45 ℃。在 45～50 ℃之间胰蛋白酶的活力虽然下降，但水解度仅降低 10%左右，影响较小；当温度到达 55 ℃时，胰蛋白酶水解度大大下降[7] 。笔者综合考虑这 2 种酶的使用特性及实际工艺的便利， 选用 50 ℃ 、pH7 恒温水浴酶解。料液比过大，底物浓度高，降低了底物蛋白分子和酶分子的集中运动，从而降低了底物和酶分子的碰撞几率，使反响速度降低； 料液比过低，水量的增加也给后续工序如浓缩增加负担[10]。依据文献和阅历，笔者选择料液比 1∶10。
不同酶解时间对三公膏得率的影响 按 1∶2∶2 的比例称取 4 份等质量的公鸡
肉、公狗肉、公羊肉，清洗干净，记录质量。加水用高压锅熬煮约 1 h，分别骨肉， 将骨和汤液一起熬煮至骨酥脆，骨头研磨成骨渣；肉捣成肉糜，将骨渣和肉糜二者 充分混匀，与汤液混合，调整料液质量比为 1∶10(公鸡、公羊、公狗肉即为固体
局部质量)，于 50 ℃水浴锅中，参加 7 000 U·g-1 木瓜蛋白酶和 5 000 U·g-1 胰蛋白酶。4 份分别水浴酶解 3，5，7，9 h，酶解过程中使用玻璃棒每隔 h 搅拌 3～5 min。酶解完毕后，过滤，5 000 r·min-1 离心 15 min，弃上层(油层)和沉淀层(残渣)，取中间清液重复上述离心 1 次，起到脱油去脂和离心除杂的作用。再取中间清液煮沸浓缩至稠膏，最终收膏即成。成膏后称重，计算成膏得率。
三公膏多肽含量测定
考马斯亮蓝法标准曲线的制备 称取 mg 牛血清白蛋白加 1 mL 去离子水配制成质量浓度为 g·L-1 的标准溶液，称取 mg 考马斯亮蓝 G-250
粉末参加 5 mL 95%乙醇和 10 mL 85%磷酸，加去离子水定容至 100 mL，得到
考马斯亮蓝溶液。取 7 支试管，其中，1 支加 mL 蒸馏水作为空白比照，其余6 支分别用移液枪移取不同体积(，，，，， mL)的
g·L-1 牛血清白蛋白标准溶液并且补加蒸馏水至 mL。7 支试管分别参加5 mL 配制好的考马斯亮蓝溶液，混合均匀，静置 5 min。在紫外-可见分光光度计595 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。
样品溶液的制备和考马斯亮蓝法测定：将酶解 3，5，7，9 h 的三公膏分别用蒸馏水配制成 1 g·L-1 溶液并且取 1 mL 于试管中，另取 2 支试管，其中一支参加 1 mL 蒸馏水作为空白比照，另一支试管参加用同样方法配置的传统熬制三公膏的溶液制成待测溶液。在 7 支试管中分别参加配制好的考马斯亮蓝溶液 5 mL，摇匀，
静置 5 min。承受玻璃比色皿在紫外-可见分光光度计 595 nm 处测得吸光度(表 3)。用所得的吸光度从标准曲线中查得相当于牛血清白蛋白的微克数，以计算样品中所 含的多肽含量。
三氯乙酸法标准曲线的绘制 依照文献[11]的方法，选用 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准品配制标准溶液。5%的三氯乙酸依次配制 0，，，，，， ，，， g·L-1 的四肽标准溶液 10 mL，然后分别取 mL 标准溶液， 参加 mL 双缩脲试剂，混匀，静置，540 nm 处测其吸光度值，并绘制标准曲
线。
三公膏样品溶液制备 将酶解 3，5，7，9 h 的三公膏和传统熬制三公膏分别用蒸馏水配制成 1 g·L-1 溶液并且分别取 1 mL 于试管中，另取 1 支试管参加1mL 蒸馏水作为空白比照。
三公膏样品溶液测定
考马斯亮蓝法测定：在 7 支试管中分别参加配制好的考马斯亮蓝溶液 5 mL，摇
匀，静置 5 min。承受玻璃比色皿在紫外-可见分光光度计 595 nm 处测得吸光度
值(表 3)。用所得的吸光度从标准曲线中查得相当于牛血清白蛋白的微克数，以计
算样品中所含的多肽含量。
三氯乙酸法测定：分别取样品溶液 mL 参加到 mL 10%三氯乙酸溶液中， 于旋涡混合仪上混合均匀，静置 20 min，然后 4 000 r·min-1 离心 10 min。取上
清液置于 50 mL 容量瓶中，并用 5%的三氯乙酸定容至刻度，摇匀。分别取 mL 样品溶液(5%的三氯乙酸定容)，参加 mL 双缩脲试剂，测定吸光度，依据标准曲线求得样品多肽含量。
结果与分析
不同酶解时间对三公膏得率的影响 在不同酶解时间下三公膏得率的测定结果见表 1。
表 1 不同酶解时间的三公膏得率 Extraction yield of Sangonggao under enzymatic hydrolisis for different hours 项 目 Project 酶解时间 hydrolytic time/h3 5 7 9 公鸡肉 Cock/ 公羊肉 He- goat/ 公狗肉 Male dog/ 成膏质量 Paste weight/ 出膏率 Extraction yield/%
由表 1 可知，随着酶解时间的延长，三公膏得率逐步提高，但 9 h %与酶解 7 h 的出膏率 %相近。考虑从削减工艺本钱动身，笔者将酶解时间定为 7 h。
三公膏多肽含量测定
考马斯亮蓝法测定的三公膏多肽含量 图 1 为牛血清白蛋白标准曲线。考马斯亮蓝法测定样品溶液的多肽含量吸光度见表 2。用所得的吸光度从标准曲线中查得相当于牛血清白蛋白的微克数，以此计算样品中的多肽含量(表 2)。
表 2 考马斯亮蓝法测定多肽含量 Determination of polypeptide content
of Sangonggao by Coomassie blue staining 工程 project 空白 Blank 传统三公膏 Traditional Sangonggao 酶解 3 h 三公膏 Hydrolyzed 3 h 酶解 5 h 三公膏Hydrolyzed 5 h 酶解 7 h 三公膏 Hydrolyzed 7 h 酶解 9 h 三公膏 Hydrolyzed 9 h 吸光度 多肽含量 Polypeptide content/%
三氯乙酸法测定的三公膏多肽含量 对于测定多肽含量有多种方法，三氯乙酸法也是常用的一种方法。承受三氯乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白质，继而承受双缩脲法，便可测定其中 2 个(含 2 个)以上肽键的多肽的含量。利用 10%的三氯乙
酸沉淀样品中未酶解的大分子蛋白质，经离心分别后，在上清液中参加双缩脲试剂， 于 540 nm 处测定其吸光度值，依据标准曲线计算出样品中的多肽含量[11]。图 2 为 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线。用所得的吸光度从标准曲线中查得相当于牛
血清白蛋白的微克数，以此计算样品中所含的多肽含量(表 3)。
样品溶液制备：将酶解 3，5，7，9 h 的三公膏样品以及购得传统熬制三公膏配成10 g·L-1 溶液，分别取 mL 参加到 mL 10%三氯乙酸溶液中，于旋涡混合
仪上混合均匀，静置 20 min，然后 4 000 r·min-1 离心 10 min。取上清液置于50 mL 容量瓶中，并用 5%的三氯乙酸定容至刻度，摇匀。
分别取 mL 样品溶液，参加 mL 双缩脲试剂，测定吸光度值，依据标准曲线求得样品多肽含量(表 3)。
表 3 三氯乙酸法测定的三公膏多肽含量 Polypeptide content of Sangonggao determined with trichloroacetic acid 工程传统三公膏Traditional Sangonggao 酶解 3 h 三公膏 Hydrolyzed 3 h 酶解 5 h 三公膏Hydrolyzed 5 h 酶解 7 h 三公膏 Hydrolyzed 7 h 酶解 9 h 三公膏 Hydrolyzed 9
h 吸光度 多肽含量/%Polypeptide
结 论
本试验根本确定了酶解法改进三公膏的工艺路线为：原材料高压蒸煮后，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶双酶酶解，酶解液过滤离心，取中间清液煮沸浓缩至稠膏，最终收膏即成。通过工艺改进，产品得率从 %提高到了 %，多肽含量从 %提高到了 %，显著缩短了产品的生产周期。用改进后的熬制工艺制得的棕褐色块状固体三公膏，比传统工艺制得的三公膏具有溶解度高，羊膻味等不良气味减弱
等优点。酶解将不易被人体吸取的骨胶原蛋白充分利用，肉糜增大了底物接触面积； 酶解离心使得脂肪含量大幅下降，既便利贮存，又改善了传统三公膏中油腻、沙硌 的口感。双缩脲法测定结果说明，酶解 9 h 较酶解 7 h 所得三公膏中多肽含量稍有降低，这可能是由于随着酶解时间增加，多肽进一步酶解成为氨基酸，降低了多肽 含量。三公膏的酶解工艺的优化和质量掌握指标等方面尚需进一步争论完善。
承受考马斯亮蓝法和三氯乙酸-双缩脲法测定三公膏中多肽含量，2 种方法测定的结果差异较大，缘由可能是考马斯亮蓝法只能测定相对分子质量>1×103 的肽含量。由于低于 1×103 的肽类的相对分子质量小，其与考马斯亮蓝染料间范德华力小，结合力差，无法显色，造成测定的多肽含量偏小。说明该法不适合测定三公膏中的多肽含量。
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