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影响
陈羽琪;南文龙;秦立得;巩明霞;张悦勇;陈义平
【摘 要】为争论热灭活、甲醛、β－丙内酯〔BPL〕三种不同灭活方法对城疫病毒〔NDV〕血凝和 RT －PCR 试验结果的影响，将收获的 NDV 鸡胚尿囊液分别用浓度为 0．1％～0．5％的甲醛 37℃灭活 24 h 或 4℃灭活 48 h、浓度为0．02％～0．2％的 BPL 37℃灭活 9 h、60℃热灭活 30～90 min，并于灭活前后进展血凝试验和 RT －PCR 检测。结果说明，用 0．02％的 BPL 37℃灭活 9 h 或 0．1％的甲醛 4℃灭活 48 h，不影响 NDV 的血凝价；承受热灭活 30 min 或0．02％的 BPL 37℃灭活 9 h，不影响 NDV 核酸检测。本争论可为相关病原检测以及诊断制品制备过程中灭活方法的选择供给参考。%In order to investigate the influence of different inactivation methods on Newcastle disease virus (NDV)hemagglutinin (HA)test and RT -PCR assay,viral suspensions were inactivated by % ~%formaldehyde for 37 ℃24 h and 4 ℃ 48 h,%
~%β-propiolactone (BPL)for 37 ℃ 9 h and 60 ℃water bath for 30 ~90 min, the suspensions were detected by HA test and RT - PCR assay. The results showed that the optimal inactivation conditions for HA were % BPL at 37 ℃ for 9 h or %formaldehyde at 4 ℃ for 48 h;for RT -PCR were 60 ℃ water bath for 30 min or % BPL at 37 ℃ for 9
h. This study provided suggestions for the selection of appropriate inactivation methods,which were used in detecting related pathogens and preparing diagnostic reagents.
【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】2025(050)009
【总页数】4 页(P11-14)
【关键词】城疫病毒;灭活;血凝;RT-PCR
【作 者】陈羽琪;南文龙;秦立得;巩明霞;张悦勇;陈义平
【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂争论室，山东青岛 266032; 西交利物浦大学生物科学系，江苏苏州 215123;中国动物卫生与流行病学中心诊
断试剂争论室，山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂争论室， 山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂争论室，山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂争论室，山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂争论室，山东青岛 266032
【正文语种】中 文
【中图分类】
在动物疫病检测时，为确保生物安全，常需对临床样品或分别培育的病原微生物进 行灭活处理。灭活也是动物疫病诊断制品制备过程中的重要环节，通过灭活可有效 消退制品在使用过程中潜在的病原集中风险。常用的物理灭活方法包括热、超声波、紫外线和 γ-射线等，化学灭活方法包括甲醛、戊二醛、β-丙内酯(beta- propiolactone, BPL)、二乙烯亚胺、盐酸聚六亚甲基胍等[1]。不同处理方法的灭
活原理不同，灭活时对病原微生物组分(如蛋白、核酸等)造成的破坏也有所差异。灭活后，进展疫病检测分析时，其检测结果与灭活前相比会受到不同程度的影响。本争论以城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)为模型，分别争论热、甲醛
及 BPL 这 3 种常用灭活方法对其血凝(HA)和 RT-PCR 试验结果的影响，以期为相
关病原检测及诊断制品制备过程中灭活方法的选择供给参考。
主要材料 NDV La Sota 株，由中国动物卫生与流行病学中心供给；10 日龄
SPF 鸡胚，购于济南斯帕法斯家禽；甲醛购自国药集团化学试剂； BPL 购自 Serva 公司；病毒 RNA 提取试剂盒购自康为世纪公司；TransScript II One-Step RT-PCR SuperMix 检测试剂盒购自全式金公司。
病毒扩增 用灭菌生理盐水将 NDV La Sota 种毒进展 10-4 稀释，尿囊腔接种
10 日龄 SPF 鸡胚，，接种后置 37 ℃连续孵化，弃去 24 h 内死亡鸡胚， 取出随后死亡的鸡胚置 4 ℃，120 h 时取出全部鸡胚，收获鸡胚尿囊液。4 ℃
2500 r/min 离心 10 min，取上清，测定血凝价。
病毒灭活
甲醛灭活 40%的甲醛溶液经稀释后参加到 5 份等量的 100 mL NDV 病毒液中，充分混匀，使甲醛终浓度分别为 %、%、%、%、%。将 5 份含有不同甲醛终浓度的 NDV 病毒液分为两组，一组置 37 ℃灭活 24 h，另一组置4 ℃灭活 48 h。
BPL 灭活 将 BPL 溶液稀释后参加到 5 份等量的 100 mL NDV 病毒液中，充分混匀，使 BPL 终浓度分别为 %、%、%、%、%，置 37 ℃ 灭活 9 h。 热灭活 将 3 等份 NDV 病毒液(100 mL/份)置 60 ℃水浴中，分别灭活 30 min、60 min、90 min。
灭活检验 取上述灭活样品各 5 mL，参照《兽用生物制品质量标准》[2]附录中灭活检验法。将各灭活留样，接种 10 日龄 SPF 鸡胚， mL/枚，每个样品接种
6 枚。接种后置 37 ℃连续孵化，每日照蛋 2～4 次，随时取出死亡鸡胚并置 4 ℃，
活胚连续孵化至 120 h 时，然后取出全部鸡胚，置 4 ℃过夜，收获尿囊液并测定血凝价。将 24 h 鸡胚死亡数≤1，48～120 h 无死亡胚，且尿囊液 HA=0 的灭活
样品视为完全灭活。
血凝价测定 参照《兽用生物制品质量标准》[2]附录中红细胞凝集试验法，测定各灭活留样的血凝价，并与灭活前病毒液血凝价比较。
RT-PCR 测定 分别取灭活前病毒液以及各灭活留样，承受无菌生理盐水 10 倍递进稀释，从 10-1 稀释至 10-6。病毒 RNA 提取参照 RNA 提取试剂盒说明书进展。引物参照《城疫诊断技术》(GB/T 16550-2025)[3]所用的检测引物，由宝生物工程(大连)合成。反响体系按 RT-PCR 检测试剂盒说明书配制，反响条件为：50 ℃反转录 30 min；94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延长 45 s，共 30 个循环；72 ℃延长 5 min。反响完毕后，用 % 琼脂糖凝胶电泳分析结果，PCR 产物送宝生物工程(大连)测序。测定各灭活留样可检出的病毒最高稀释倍数，并与灭活前病毒液比较。
灭活检验 按所述方法检测各灭活留样的灭活效果，承受浓度为 %～%的甲醛灭活时，无论 37 ℃灭活 24 h 或 4℃灭活 48 h，灭活的病毒样品再次接种鸡胚后，收获的尿囊液血凝价均为 0，证明灭活完全；承受浓度为 %～%的BPL 37 ℃灭活 9 h，经检测均灭活完全；承受 60 ℃30 min、60 min、90 min 热灭活，经检测均灭活完全。
灭活前后血凝试验检测 结果见表 1。病毒灭活前，经测定病毒液血凝价为 210。用甲醛灭活，灭活温度为 37 ℃时，随着甲醛浓度从 %增加至 %，灭活后的 病毒液血凝价下降到 29～26；灭活温度为 4 ℃时，在不同的灭活浓度下，灭活后的病毒液血凝价与灭活前保持全都，均为 210。用 BPL 灭活时，灭活浓度从 % 增加至 %，灭活后的病毒液血凝价与灭活前保持全都，均为 210。承受 60 ℃
热灭活，灭活时间从 30 min 增加至 90 min，灭活后的病毒液均检测不到血凝价。
灭活前后 RT-PCR 检测 结果见表 2。病毒灭活前，RT-PCR 可检测到的病毒最高稀释倍数为 10-3。甲醛灭活时，无论承受 37 ℃或 4 ℃灭活，或是灭活浓度从
%增加至 %，灭活后的病毒液均检测不到病毒核酸。BPL 灭活时，灭活浓度
为 %时，灭活后可检测到的病毒最高稀释倍数与灭活前全都，仍为 10-3；随着灭活浓度从 %增加至 %，灭活后可检测到的病毒最高稀释倍数有所下降，但仍可检测到 10-2 稀释的病毒液。60 ℃热灭活时，灭活时间从 30 min 增加至 90 min，灭活后可检测到的病毒最高稀释倍数均和灭活前全都，为 10-3。
甲醛是传统的灭活剂[6-7]，通过对蛋白和核酸的烷化作用使病毒或细菌丧失感染性[4]。本争论中，37 ℃或 4 ℃条件下 %～%甲醛灭活后，NDV 核酸构造受损，RT-PCR 检测结果均为阴性。37 ℃灭活时，随甲醛浓度上升，NDV 血凝价呈下降趋势，这可能与血凝素蛋白变性发生交联反响而致抗原性破坏有关。承受 4 ℃灭活，则可抑制上述交联反响，有效保存血凝素蛋白的抗原性。不过，在相关
诊断制品(如城疫抗原、禽流感抗原等)制备过程中，甲醛灭活浓度、温度、时间， 还需依据生物材料的特性及具体工艺，敏捷选择。
BPL 在国外广泛用于疫苗灭活，其作用于病原体 DNA 或 RNA，通过与核酸的嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反响破坏核酸构造，但不直接作用于蛋白质，因此能保持良好的抗原活性。同时，BPL 灭活病原时间短，且易水解为无毒性的人体脂肪代谢产物 β-羟基丙酸，故不必考虑在成品中的残留[8]。本争论承受 %～%BPL
进展灭活，在 NDV 完全灭活的状况下，灭活前后血凝价保持不变，效果较为抱负。同时，BPL 虽然直接作用于核酸，当承受 %的浓度进展灭活时，灭活前后
RT-PCR 检测结果未受影响；当浓度增加到 %～%时，RT-PCR 可检测病毒最高稀释倍数降低至 10-2，但与甲醛相比，BPL 灭活对 RT-PCR 检测结果影响相对较小。本争论说明，用 %的 BPL 37 ℃ 9h 灭活效果较好，既保持了NDV 血凝素蛋白的抗原性，又不会影响 RT-PCR 检测。
热灭活简洁易行，但简洁造成病原体蛋白质变性，进而使抗原活性受到影响。本争论承受热灭活后，均检测不到血凝价，说明血凝素蛋白变性而失去其抗原性。但热
灭活对核酸检测影响较小，灭活 30～90 min，均不会影响 RT-PCR 检测结果，该
方法较适用于分子检测试剂的质控品、比照品的制备。
本争论显示，3 种灭活方法对 NDV 血凝性的影响，依次为热灭活﹥甲醛﹥BPL； 对 NDV 核酸检测的影响，依次为甲醛﹥BPL﹥热灭活。因此，城疫血凝和血凝
抑制试验时，推举承受 %的 BPL 37 ℃灭活 9 h 或 %的甲醛 4 ℃灭活 48 h； NDV 核酸检测时，建议热灭活 30 min，也可用 %的 BPL 37 ℃灭活 9 h。实
际应用中，可依据检测目的以及病原微生物的种类和生物学特性，合理选择灭活方法及灭活条件。
【相关文献】
徐守振，尹燕博，王．动物疫苗中常用抗原灭活剂的争论进展[J]．中国畜牧兽医，2025， 37(9)：162-167．
中华人民共和国农业部．中华人民共和国兽用生物制品质量标准[S]．北京：中国农业科技出版 社，2025．
[3] 城疫诊断技术(GB/T 16550-2025)[M]．北京：中．兽医生物制品学[M]．第 2 版．北京：中国农业出版社，2025．
徐守振，王，尹燕博．四种不同灭活剂对城疫病毒的灭活效果争论[J]．中国家禽，2025， 33(14)：15-19．
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