文档介绍：该【细胞生物学研究方法 】是由【知识徜徉土豆】上传分享，文档一共【25】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【细胞生物学研究方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一、章（节、目）授课计划 第 页
授课章节名称
第三章 细胞生物学研究方法
授课
时数
2
教
学
目
的
1、使学生掌握细胞形态结构的观测方法，了解重要工具，侧重掌握基本原理和基本应用
2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养
3、了解细胞工程技术
教
学
要
求
1、掌握细胞形态结构的观测方法，掌握光学显微镜技术
2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养
3、了解细胞工程技术
教
学
重
点
1、细胞形态结构的观测方法
2、细胞组分的分析方法及细胞培养。
教
学
难
点
1、观测细胞形态的重要方法及工具的介绍。
2、细胞组分的分析方法
教学
方法与手段
讲授法、 互动讨论法
作业与
思考题
部分课后作业
阅读
书目或参考
资料
1、《细胞生物学》（第3版）(翟中和等)(高等教育出版社)（2023）
2、《细胞生物学进展》（郑国錩等）（高等教育出版社）（1994）
3、《分子细胞生物学》（韩贻仁）（高等教育出版社）（2023）
教
学
后
记
二、课时教学内容 第 页
教 学 内 容
小结
技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有
显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。
细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。
第一节 细胞形态结构的观测方法
一、有关显微镜的一些概念
（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。
光学显微镜的分辨率 R=．sin（α/2）．
其中λ为入射光线波长；
N =介质折射率；空气中N =1
α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与相应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。
例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本， 放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。
显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。
（3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼可以分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数：
M=d′/d
二、显微镜的分类
现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
教 学 内 容
小结
显微镜 。这两类显微镜又可根据不同的情况提成若干类型。
三、光学显微镜技术
光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。
（一）普通复式光学显微镜技术
1. 构成：
①照明系统：光源、折光镜、聚光镜
②光学放大系统：为两组玻璃透镜，目镜与物镜
③机械装置和支架系统，由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋等部件组成，保证光学系统的准确配置和灵活调控。
2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
教 学 内 容
小结
（二）相差和微分干涉显微镜技术
光线在通过密度不同的介质时，其滞留限度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，提高了各种结构间的对比度，明暗差别通过密度差形成
使各种结构变得清楚可见。用途：观测未经染色的玻片标本，样品不需染色，适合观测活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。
在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。
相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
微分干涉显微镜用的是偏振光，增长了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。
教 学 内 容
小结
（三）荧光显微镜技术
特点：光源为短波光；
有两个特殊的滤光片（激发光滤片，阻断滤片）
照明方式通常为落射式（这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是合用于非透明物体，检出能力高；对细胞的刺激小；能进行多重染色）。
原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质自身虽不能发荧光，但假如用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具
应用：直接荧光标记技术
间接免疫荧光标记技术
（四）激光共聚焦显微技术
原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点（所谓共焦，是指物镜和聚光镜同时聚焦在同一点上），也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不同样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观测细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度记录以及细胞形态的定量。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。优点是排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(—)，可重构样品的三维结构。
教 学 内 容
小结
（五）荧光共振能量转移（FRET）技术
是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的互相作用。
FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸取光谱重叠，
并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。
采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于5～10nm。
FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。
（六）荧光漂白恢复技术
又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运
动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。
原理：运用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬
灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完毕。
用于检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小
四、电子显微镜技术
用于研究细胞内部的精细结构。
（一）、电子显微镜的基本知识
1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别
显微镜
分辨本领
光源
透镜
真空
成像原理
LM
TEM
200nm
100nm
可见光（400-700）
紫外光
（约200nm)
电子束
（-）
玻璃透镜
玻璃透镜
电磁透镜
不规定真空
不规定真空
规定真空
-5～-3Pa
运用样品对光的吸取形成明暗反差和颜色变化
运用样品对电子的散射和透射形成明暗反差
教 学 内 容
小结
2、电子显微镜的特性
以电子束作光源，电磁场作透镜。
由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统等4部分构成；
，放大倍数可达106；
用于观测超微结构（µm）。
（二）重要电镜制备技术
1、超薄切片技术
用于电镜观测的样本制备。通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推动的方式推动样品切片，切片厚度20-50nm。
由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。这需要样品具有一定的刚性和韧性，而生物样品不具有这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品固定。
（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在本来位置上
通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。
（2）包埋：各种细微结构在切片过程中获得均匀良好的支撑，使获得的超薄切片连续完整并有足够的强度，且能耐受观测时的电子轰击、高温和真空挥发。
常用的包埋剂为环氧树脂。注意：生物样品固定后仍具有大量水分，而包埋剂是与谁不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脱水解决。
（3）切片：通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩控制切片厚度。
切片刀：玻璃或砖石。切片需捞在覆有支撑膜的载网上才干在电镜下观测。
（4）染色：用重金属盐染色以形成明暗反差，只能观测到黑白图像
不同的成分对不同的燃料有不同的亲和性：锇酸—脂质；铅盐—蛋白质；醋酸铀—核酸。
2、负染技术
用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，烘托出样品的精细结构，。
教 学 内 容
小结
3、冰冻蚀刻 freeze-etching
亦称冰冻断裂蚀刻复型。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，
冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。
复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞
断裂面处的结构。
用来观测膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构，立体感，不需要包埋、固定
深度蚀刻重要用来观测胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白。
4、电镜三维重构技术
将电子显微镜、电子衍射、计算机图像解决相结合的技术。用于分析难形成晶体的膜蛋白、病毒和蛋白质-核酸复合物的三维结构。
生物样品的二维晶体在不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片，傅里叶变换解决，得到三维结构电子密度图
展示生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，具有高分辨率
5、扫描电镜技术（SEM）
扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观测标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。
五、扫描隧道显微镜（STM）
它于1981年由格尔德·宾宁 (Gerd )及亨利希·罗勒(Heinrich Rohrer)在IBM位于瑞士苏黎世的苏黎世实验室发明扫描隧道显微镜，只一种在纳米水平上探测微观世界物质表面形貌的一仪器。
原理：扫描探针与样品接触或达成很近距离时，即产生彼此间互相作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在
教 学 内 容
小结
计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。
重要装置：
XYZ方向扫描的压电陶瓷、
逼近装置、
电子学反馈控制系统、
数据采集、解决和显示系统
重要特点：
具有原子尺度的高分辨本领：-，
真空、大气、液体条件下工作
非破坏性测量
局限性：
扫描隧道显微镜(STM)所观测的样品必须具有一定限度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则主线无法直接观测。
在扫描隧道显微镜(STM)的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不可以准确探测，与此相关的分辨率 较差。
第二节 细胞组分的分析方法
形态学观测和细胞成分的分析相结合是当代细胞生物学研究中长采用的实验方法。
一、细胞组分分离技术
是分离细胞器及各种大分子基本手段。
转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。
转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。
超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。
（一）差速离心 Differential centrifugation
特点：
介质密度均一；
速度由低向高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
教 学 内 容
小结
沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
（二）密度梯度离心
用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
类型：速度沉降、等密度沉降。
常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
分离活细胞的介质规定：
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
2）PH中性或易调为中性；
3）浓度大时渗透压不大；
4）对细胞无毒。
1. 速度沉降 velocity sedimentation
用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。
特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达成分离。
isopycnic sedimentation
用途：分离密度不等的颗粒。
特点：
介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。
力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。
原理：样品各成分在连续梯度的介质中通过一定期间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达成平衡，从而将不同密度的成分分离。