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(完整word版)qPCR的原理
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原理
（1） PCR： Polymerase chain reaction。 是体外模拟生物的DNA 复制。需
要DNA 聚合酶，DNA 模板,两端引物，脱氧核苷酸dNTPs（ dATP, ACTP, dGTP，
dTTP)，以及适当的缓冲体系。
PCR 产物的增长形式为２N （如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是
循环数)。实际中，扩增效率不为100％.
Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的.（普
通）PCR 包含很多因素，属性,如：试剂，温度，循环数，程序,PCR 产物(扩
增子,amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线）,掺错率，扩增子长度。
一般来说, time PCR 主要利用的是扩增曲线
(amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以
考虑。
普通PCR 是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。对于判
断目的DNA 有没有， 有多少分子（初始的时
候），则勉为其难。因为PCR 的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为,
PCR 的起始若干循环内，由于原料,酶的充足,抑制子（抑制PCR 的因素,如dNTPs 分解产生焦磷酸）的量少,PCR 可以是理想的-—即每个循环后扩增子
增加一倍。然而到了一定时候,原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相
对较高，PCR 的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S"型的，
而不是“J”型。
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图2：扩增曲线。
理想：J 型，2N 方程。
实际：S 型。分为:不可检测期，指数期，平台期。
这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的：配好若干(如40)相同的
PCR 体系,分别进行1，2，3……40 个循环，再用测OD 等定量方法来知道有多
少扩增子产生，作图。
由于对极少量DNA（1～数千？)的直接定量办法还没有,该扩增曲线的最初
若干循环,扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开.
Real time PCR 同样不能直接测出初始DNA 的分子数，不过，它采用的数据
是在PCR 中期，比末期定量要准确。(更接近理想情况。）
（2）Real time PCR 的化学基础
real time PCR 是普通PCR 的一项改进,使用了针对扩增DNA 的荧光物质,
使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系,大致得到DNA 的扩增曲线
（如,图2，3）。
图3:real time PCR 的扩增曲线. 名词解释：
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•Rn:一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。（Normalized with ROX-参比染料。)
•Rn+：反应管含有模板DNA。
•Rn—:反应管不含有模板DNA。
•无模板对照：No template control，Rn—，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数
值.
•Threshold: 荧光（Rn）超过本底-—达到可检测水平时的临界数值.
•Ct: threshold cycle,临界循环数,threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循
环数。
•基线：baseline， 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直
到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。 ）