文档介绍：实验六定磷法测定核酸浓度
。
,并由此计算核酸的量。
钼蓝法比色定磷的原理
1)钼蓝显色剂+ 无机磷钼蓝复合物
2)在一定范围内,蓝色的深浅和磷的量成正比,可用比色法测定
实验原理
实验内容
标准磷溶液定磷曲线的制作;
RNA消化;
测定RNA消化液总磷含量;
计算RNA溶液中RNA的浓度。
1、标准曲线(定磷曲线)的用途
管号
步骤
1
2
3
4
5
6
7
8
标准磷溶液/mL
0
H2O/mL
3
定磷试剂/mL
3
3
3
3
3
3
3
3
反应条件: 45℃,25min 660nm测定吸收值
磷含量(μg)
A660nm
RNA消化的目的?
为什么将原液消化算回收率?
总磷
无机磷
RNA磷
测定值
DNA磷
消化回收率
根据标准磷原液计算回收率
直接用钼蓝法进行测定
由总磷量和无机磷量计算可得
核酸
试剂与器材
1. 钼蓝显色剂
2. 标准磷试剂、标准磷原液
3. 分光光度计
4. 烧杯、搅拌棒、滴管、容量瓶
5. 凯氏烧瓶
6. 试管
7. 水浴锅
* 本实验配置试剂所用的水指的是蒸馏水
三、试剂和器材
四、操作步骤
1)标准曲线样品的准备(4组同学,测三条标准曲线)
2)无机磷的测定(另外一组同学做总磷测定和无机磷测定)
试剂
0
1
2
RNA样品/ml
-
蒸馏水
0
0
定磷试剂
A660nm
3)反应条件: 45℃,25min
管号
步骤
1
2
3
4
5
6
7
8
标准磷溶液/mL
0
H2O/mL
3
定磷试剂/mL
3
3
3
3
3
3
3
3
滤纸过滤
3)总磷样品的准备(八人一组)
管号
步骤
0
1
2
3
4
RNA/mL
-
2
2
-
-
标准磷原液/mL
-
-
-
2
2
H2O/mL
1
-
-
-
-
10mol/L H2SO4/mL
4
4
4
4
4
168-200℃消化30min,溶液呈黄褐色,冷却
30%H2O2(滴)
2
2
2
2
2
168-200℃继续消化至溶液透明,冷却
H2O/mL
1
1
1
1
1
沸水浴中加热10min(分解焦磷酸),冷却
用水定容/mL
100
100
100
100
100
显色方法P19
3. 注意事项
1)清洗实验用容器不要用含磷清洗剂
2)消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
五、结果及数据处理
1) 标准曲线
2) 总磷量计算
回收率的计算
样品总磷浓度( ug/ml)计算:P真实=P测定/回收率
3) 有机磷=总磷-无机磷
4) 核酸含量计算
计算得知有机磷的浓度(ug/mL),,便可求得该RNA样品中磷的含量(ug),因核酸中含磷酸量为9%左右,1ug磷相当于11ug核酸,进一步计算出样品中RNA的含量(%)。