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李月婷;刘影;王静娴;李靖;肖婷婷;王爱民;廖尚高;王永林
【摘要】Objective: To explore the similarity of the damage effect of hydrogen peroxide ( H2 02 ) on cardiac cell H9c2 and primary cardiac myocytes. Method: H9c2 cells and primary cardiac myocytes of neonatal rats were selected, and the effects of different concentration of H2O2 on the activity of H9c2 cells and primary cardiac myocytes were measured wilh MTT method, and their sensitivity to oxidative damage induced by H2O2 was observed. Result; In the concentration range of 600 ~1 600 μm · L-1 , H9O2 caused oxidative damage to these two kind of cells in a dose-dependent manner. The viability of H9e2 cells was reduced by 40%
~60% when the concentration of H2O2 was 1 200 μm · L , which was similar to that of primary cardiac myocytes. Conclusion; H2O2 has similar
oxidative damage effect on H9c2 cells and primary cardiac myocytes.% 目的: 考察过氧化氢对 H9c2 :选用
H9c2 心肌细胞与生大鼠原代心肌细胞,应用 MTT 法测定不同浓度过氧化氢对H9c2 心肌细胞及原代心肌细胞活性的影响,观看两株细胞对过氧化氢损伤的敏感性. 结果:600～1 600μ mol/L 的过氧化氢对 H9c2 心肌细胞及原代心肌细胞所造成的氧化损伤均具有浓度依靠性,1 200 μmol/L 的过氧化氢使 H9c2 心肌细胞的存活率降低 40％～60％ (P<),表现出与原代心肌细胞相像的 H2O2 损伤敏感性(P>).结论:H9c2 心肌细胞与原代心肌细胞对过氧化氢氧化损伤具有相像的作用和浓度依靠性.
【期刊名称】《贵阳医学院学报》
【年(卷),期】2025(037)003
【总页数】3 页(P225-227)
【关键词】过氧化氢;氧化损伤;细胞,培育的;H9c2 细胞
【作者】李月婷;刘影;王静娴;李靖;肖婷婷;王爱民;廖尚高;王永林
【作者单位】贵阳医学院药学院,贵州贵阳 550004;贵阳医学院药学院,贵州贵阳550004;贵阳医学院药学院,贵州贵阳 550004;贵阳医学院药学院,贵州贵阳
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550004
【正文语种】中文
【中图分类】R363
建立体外心肌细胞氧化损伤模型已成为争论心肌缺血再灌注损伤的常用试验方法，但由于分别培育原代心肌细胞的技术要求较高，且心肌细胞属于终末分化细胞，每次试验需要重分别心肌组织，批间差异大，重复性不好［1］。本试验争论中承受易于培育、可传代的 H9c2 心肌细胞与原代心肌细胞模型，观看过氧化氢对细胞的影响，以期提高心肌细胞培育的效率，为 H9c2 心肌细胞的应用供给试验依据。1 材料与方法
试验动物及细胞
安康生 1 ～3 d 的 Sprague-Dawley 大鼠，购于贵阳医学院试验动物中心，合
格证号 SCXK(黔)2025－0001;H9c2 细胞株，购自中国科学院上海细胞库。
主要仪器及试剂
仪器:双人双面超净台(哈东联)、低速台式离心机(上海安亭)、倒置显微镜(尼康)、CO2 培育箱(Thermo)、酶标仪(Bio-rad)、磁力搅拌器(上海司乐);试剂:高糖DMEM 培育基(Gibco)，胎牛血清(Biochrom)，胰蛋白酶(Solarbio)，胶原酶
Ⅰ(Sigma)，5-溴脱氧尿苷(Sigma)，台盼蓝(Sigma)，MTT(Sigma)，过氧化氢等。
生大鼠原代心肌细胞的分别与培育
心肌的取材取生大鼠(1 ～3 d)，75%乙醇浸泡;无菌条件下，直接剪取心室肌放入含有预冷 PBS 的培育皿中，清洗血渍后放入预冷的无血清培育液中备用; 重复以上过程，直至收集全部心室肌。
分别与培育取心室肌放入含有无血清培育液中剪成约 1 mm3 大小的碎块，用含 %的胰酶(含 %EDTA-Na2)、%胶原酶Ⅰ的混合酶置 37 ℃水浴，磁力搅拌器消化 8 min，1 000 r/min 离心 10 min，收集细胞沉淀用 37 ℃预热的含 10%胎牛血清的培育液制成单细胞悬液;剩余组织用同样方法处理，直至消化完全;将所得单细胞悬液收集在 50ml 培育瓶中，置于 5% CO2 培育箱中 37 ℃培育 90 min，差速贴壁分别纯化心肌细胞，台盼蓝测定细胞存活率，以细胞密度(30 ～40)×104 个/ml 种植于 96 孔培育板中，培育前 2 天，参加 mol/L 的
5-Brdu 抑制非心肌细胞生长，48 h 后换液，72 h 后选择状态良好的细胞用于试验。
H9c2 心肌细胞培育
H9c2 心肌细胞置于含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培育基中于 37 ℃、5%CO2 条件下传代培育。取对数生长期、生长良好的细胞，以细胞密度(20 ～30)×104
个/ml 种植于 96 孔培育板中，将培育板置 37 ℃、5%CO2 培育箱中孵育 48 h 后，用于试验。
建立过氧化氢损伤模型
取生长状态良好的原代心肌细胞及 H9c2 心肌细胞，分别设正常比照组、不同浓度H2O2(600，800，1 000，1 200，1 600 μmol/L)组。除正常比照组外，各组均参加相应的过氧化氢作认真肌细胞 4 h 后用 MTT 法检测。每孔换液参加 g/L 100 μl 用 PBS 配制的 MTT 溶液，连续在培育箱中孵育 4 h，然后吸去上清液，每孔参加 150 μl DMSO 溶解蓝紫色结晶，用酶标仪检测 490 nm 波特长每孔的光密度值(OD 值)。
数据处理
承受 SPSS()统计软件包进展 One-Way ANOVA 检验分析，并对组间数据进展 Dunnett 或 Dunnett`s T3 检验;各组数据承受均值±标准差±s)表示，检验水准α 为。
结果
原代心肌细胞的成活率和形态
差速贴壁纯化后的心肌细胞，承受 %的台盼蓝染液测定其存活率约为 90%。心肌细胞培育 24 h 后，镜下可见大局部细胞已贴壁生长，呈三角形或不规章星形，单个细胞搏动(图 1);培育 1 ～3 d，细胞渐渐长出伪足，并交接成网，逐步形成单层和呈放射状排列的细胞簇，每个簇内的心肌细胞实现同步搏动(图 2)，搏动频率为:65 ～85 次/min。
不同浓度 H2O2 对心肌细胞存活率的影响
试验结果显示(图 3)，用 600 ～1 600 μmol/L 的 H2O2 处理心肌细胞 4 h，会对2 株心肌细胞造成具有相像浓度依靠性变化趋势的氧化损伤，600 μmol/L 的H2O2 处理 H9c2 心肌细胞及原代心肌细胞均会显著降低细胞存活率(P ＜);1
200 μmol/L 的 H2O2 能使 H9c2 心肌细胞的存活率降低 40%～60%(P ＜)，
表现出与原代心肌细胞相像的 H2O2 损伤敏感性(P ＞)。
图 3 H2O2 对原代心肌细胞及 H9c2 细胞的氧化损伤(MTT 法) H2O2 induced oxidative damage to primary cardiac myocytes and H9c2 cells 注: 与比照组比较，(1)P ＜，(2)P ＜。
争论
缺血心肌再灌注时产生的大量氧自由基(oxygen free radical，OFR)导致线粒体呼吸链功能障碍，最终引起心肌细胞的凋亡或坏死，是心肌缺血再灌注损伤(Myoedarial Isehemia RepeurfsionInjury，MIRI)的主要机制之一［ 2］。因此，探究心肌缺血再灌注损伤的病理机制，对防治心肌缺血再灌注损伤性疾病具有乐观意义。
体外培育的心肌细胞模型具有特异性高、模拟性强的特点，且不受神经、体液等因素的影响，已成为心血管药理争论的根本方法和手段之一［3］。但由于分别培育原代心肌细胞一般以成年或生动物的心肌组织为材料，易受各试验室条件等因素的影响，且心肌细胞属于分化成熟细胞，不能传代，增加了试验难度，延长了试验周期，不适于大批量开展争论。争论认为，从大鼠胚胎心脏分别得到的心肌样、呈未分化表型的 H9c2 心肌细胞株，具有心肌细胞的形态构造［4］，与原代心肌细胞的局部电生理特性相像［1］，且其易获得，可传代、性质相对稳定。因此，本试验引入了 H9c2 心肌细胞，将其与原代心肌细胞进展了氧化损伤比照争论，探讨过氧化氢对 H9c2 心肌细胞与原代心肌细胞氧化损伤作用的相像性。
心肌细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性能够反映心肌细胞损伤程度，是评价心肌细胞存活的重要指标之一［5］。本试验承受 MTT 法检测了氧化损伤后心肌细胞中 SDH 的活性，试验结果显示，经不同浓度过氧化氢损伤后，H9c2 心肌细胞及原代心肌细胞的存活率表现出相像 H2O2 浓度依靠性的降低;1 200 μmol/L
的过氧化氢使 2 株心肌细胞的存活率均降低 40%～60%，且两株细胞存活率无统
计学差异，提示了 H9c2 心肌细胞表现出与原代心肌细胞相像的 H2O2 损伤敏感性，其与原代心肌细胞对过氧化氢氧化损伤具有相像的作用和浓度依靠性。
参考文献
［1］李晓宇，赵焕，王晓棵，细胞株在心肌缺氧/复氧试验中的应用
［J］.中国心血管病争论，2025(5):374－377.
［2］郭健，刘义，李延平，［J］.中国心血管杂志，2025(5):384－387.
［3］马芳芳，沈晓丽，林立芳，［J］.心血管康复医学杂志，2025(2):125－128.
［4］［D］.广东药学院，2025:27－28.
［5］蒋丽敏，佟梅丽，［J］.中成药，2025(2):265－266.