还原糖的测定.ppt

文档介绍：还原糖的测定 ——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
1. 掌握还原糖和总糖测定的基本原理,
2. 学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
·在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖
的含量。
·由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子
水,。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 实验材料
小麦面粉。
2. 主要仪器
(1)比色管:25mL
(2)大离心管:50mL×2
(3)烧杯:100mL
(4)三角瓶:100mL
(5)容量瓶:100mL
(6)刻度吸管:1mL;2mL;10mL
(7)恒温水浴锅
(8)离心机
(9)电子天平
(10)分光光度计
3. 试剂
(1)1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
DNS和262mL 2M NaOH溶液,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准液、蒸馏水和
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
摇匀,沸水浴加热5min
反应液冷却至室温
蒸馏水定容至25mL(混匀)
540nm下测光密度值
绘出标准曲线
表1 葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
(mL)
蒸馏水
(mL)
DNS
(mL)
葡萄糖含量
(mg)
光密度值
(OD­540nm)
0
0
2

0
1




2




3




4




5




6




2. 样品中还原糖的测定
(1)还原糖的提取

放入100mL烧杯少量蒸馏水调成糊状,再加35mL蒸馏水
50℃恒温水浴20min
4 000r/min下离心5min
收集上清液
定容为100mL,待用
20mL水洗一次,离心,合并上清