(保健食品实验）增强免疫力功能.ppt

文档介绍：增强免疫力功能评价及其检测方法
试验项目
脏器/体重比值:胸腺/体重比值,脾脏/体重比值
细胞免疫功能测定:小鼠脾淋巴细胞转化实验, 迟发型变态反应
体液免疫功能测定:抗体生成细胞检测,血清溶血素测定
单核-巨噬细胞功能测定:小鼠碳廓清试验,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
NK细胞活性测定
试验原则
所列指标均为必做项目
采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验
试验检测方法
实验动物    推荐用近交系小鼠,如C57BL/6J、BALB/C等,6-8周龄,18-22g,雌雄均可,数量为单一性别,每组10-15只。
剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个空白对照组,以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组,另设二各剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天,免疫模型动物实验可适当延长。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
原理    当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色结晶而显色,其光密度值能反映细胞的增殖情况。
仪器和材料    RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液(-)    200目筛网、24孔培养板,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
试剂配制完全培养液  RPMI1640培养液过滤除菌,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰***(200mmol/L),青霉素(100U/mL),链霉素(100ug/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1mol/L的HCl或1mol/-,即完全培养液。ConA液  用双蒸水配制成100ug/mL的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(-20℃)保存。无菌Hank's液  %-。MTT液  将5mgMTT溶于1mL ,现配现用。酸性异丙醇溶液  96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl,临用前配制。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
脾细胞悬液制备无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,用Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为3×106个/mL。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1mL,一孔加75μL ConA 液(),另一孔作为对照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h,,,同时加入MTT(5mg/mL)50μL /孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装3~6孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中,721分光光度计上在波长570nm测定OD值。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
数据处理及结果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< ,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥,P≤,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值,可判定该项实验结果阳性。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验-MTT法
注意事项选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要,ConA的浓度过高会产生抑制作用,不同批号的ConA在实验前要预试,以找到最佳刺激分裂浓度。